Die Messung der Wachstumsrate von Bakterien ist eine grundlegende mikrobiologische Technik und wird häufig in der Grundlagenforschung sowie in landwirtschaftlichen und industriellen Anwendungen eingesetzt.
Bakterien gehören zu den häufigsten Lebensformen auf der Erde und sind in jedem Ökosystem, einschließlich des menschlichen Körpers, vorhanden. Bestimmte Bakterienarten sind auch genetisch hoch traktierbar und wurden als Forschungsmodelle oder zur Herstellung von natürlichen oder synthetischen Produkten im industriellen Maßstab genutzt., Allerdings können nicht alle Bakterienarten im Labor kultiviert werden. Für diejenigen, die können, ist ein wichtiges Merkmal die Multiplikationsrate oder „Wachstumskinetik“.
Die Messung der Wachstumsrate einer Bakterienkultur kann Wissenschaftler über ihre physiologischen und metabolischen Funktionen informieren und ist auch nützlich, um eine genaue Zellzahl der Bakterien für nachgeschaltete Anwendungen zu erhalten.,
In diesem Video werden die Prinzipien der Bakterienwachstumsratenanalyse vorgestellt, ein Protokoll zur Charakterisierung der Wachstumsrate mit einer „Wachstumskurve“ demonstriert und schließlich verschiedene umweltwissenschaftliche Anwendungen zur Messung der Bakterienwachstumskinetik untersucht.
Bakterien vermehren sich im Allgemeinen asexuell und vermehren sich durch einfache binäre Spaltung, wobei sich eine Elternzelle in zwei identische Tochterzellen teilt., Unter günstigen Wachstumsbedingungen, bei denen Nährstoffe im Überfluss verfügbar sind und Umweltparameter wie die Temperatur alle dem Wachstum förderlich sind, übersteigt die Multiplikationsrate bei weitem die Sterblichkeitsrate. Dies führt zu exponentiellem Wachstum.
Durch Messung der Menge der Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit kann eine Wachstumskurve erhalten werden. Das Wachstum von Bakterien in einer flüssigen Kultur unter optimalen Bedingungen erzeugt eine Wachstumskurve mit einer charakteristischen Form, die in verschiedene Phasen unterteilt werden kann., Die Kurve beginnt mit einer“ Verzögerungsphase“, in der das Wachstum langsam ist, während sich die Bakterien an die Kulturbedingungen gewöhnen. Als nächstes ist die “ Log „oder“ exponentielle Phase“, wenn die Bakterien exponentielles Wachstum erfahren. Das Wachstum stoppt schließlich, sobald die Nährstoffe aufgebraucht sind und sich Abfallprodukte ansammeln, was zu einer „stationären Phase“führt. Sobald die Multiplikationsrate durch die Zelltodesrate überholt ist, tritt die Kultur schließlich in die „Todesphase“ein.,
Um eine Wachstumskurve zu konstruieren, werden Bakterienzahlen in einem Kolben flüssiger Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten über einen bestimmten Kultivierungszeitraum gezählt. Bakterienzahlen können durch eine Reihe verschiedener Methoden erhalten werden. Ein gängiger Ansatz ist die Messung der optischen Dichte – oder „OD“ – 600, der Lichtabsorption der bakteriellen Lösung bei einer Wellenlänge von 600 nm.
Eine andere Methode besteht darin, die „CFU“ oder koloniebildende Einheiten pro Milliliter der Kultur zu bestimmen., Aufgrund der klonalen Natur des Bakterienwachstums kann sich ein Bakterium in einer Kultur theoretisch zu einer beobachtbaren Kolonie auf einer Agarplatte ausdehnen. Durch Plattieren einer Reihe von Verdünnungen einer Bakterienkultur, um eine Bakterienkonzentration zu erreichen, bei der einzelne, diskrete Kolonien beobachtet werden können, eine Methode namens „serielle Verdünnungsplattierung“, kann die Kolonienzahl verwendet werden, um die Bakterienkonzentration in Bezug auf CFU pro ml zu berechnen.,
Nachdem Sie nun verstanden haben, wie das Bakterienwachstum analysiert werden kann, führen wir ein Protokoll zur Durchführung einer Wachstumskurvenanalyse an Reinkulturen eines etablierten Bakterienmodells, Escherichia coli, unter Verwendung der seriellen Verdünnungsplattierungsmethode durch.
Einen Tag vor der Zeitpunktsammlung 20 ml vorsterilisierte Trypticase-Sojabrühe oder TSB-Medium in einem 50-ml-Kolben mit einer einzigen E. coli-Kolonie inokulieren.
Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C unter schütteln. Bei E. coli würde dies zu einer stationären Phasenpopulation von etwa 109 KBE/ml führen.,
Am folgenden Tag 100 µL der Nachtkultur in 250 ml TSB in einem 500-ml-Kolben inokulieren. Gründlich mischen. Dadurch entsteht eine verdünnte Kultur von etwa 4 x 105 KBE / ml. Lagern Sie 5 ml dieser verdünnten Kultur in einem Kulturröhrchen. Dies ist das Aliquot vom Zeitpunkt 0 oder T0. Sofort bei 4 °C kühlen
Das Restvolumen der Kultur bei 37 °C mit Schütteln inkubieren. Sammeln Sie zu jeder Stunde danach bis zu 8 h 5-mL-Aliquots aus der Kultur. Bezeichnen Sie diese Proben T1 bis T8 und lagern Sie sie alle bis zur Verwendung bei 4 °C.,
Entfernen Sie am Tag des Experiments die E. coli time point Aliquots aus dem Kühlschrank und halten Sie sie auf Eis. Verwenden Sie sterile Mikrofugenröhrchen mit jeweils 900 µL steriler Kochsalzlösung, um eine Verdünnungsreihe für jedes Aliquot gemäß der folgenden Tabelle einzurichten.
Mischen Sie die T0-Kultur gut, indem Sie vorsichtig wirbeln, und geben Sie dann 100 µL in Tube A seiner Verdünnungsreihe, wobei Sie eine 1-in-10-oder 10-1-Verdünnung vornehmen. Vortex Tube A zum Mischen und unter Verwendung einer frischen Pipettenspitze 100 µL Tube A zu Tube B geben, wobei die 1-in-100-oder 10-2-Verdünnung erfolgt.,
Wiederholen Sie den Vorgang für jede Kultur aliquot und machen Sie die entsprechende Verdünnungsreihe gemäß Tabelle 2. Sobald die Verdünnungsreihen für alle Zeitpunktproben hergestellt wurden, lassen Sie die entsprechende Anzahl steriler Trypticase-Soja-Agar-Platten für die bakterielle Beschichtung vorbereiten.
3 Verdünnungen jeder Zeitpunktkultur werden gemäß der folgenden Tabelle in dreifacher Ausfertigung plattiert. Beschriften Sie die Platten entsprechend. Anschließend pipettieren Sie 100 µL jeder entsprechend verdünnten Kultur auf die Mitte der jeweiligen Agarplatte., Flammensterilisieren Sie einen “ L “ – förmigen Glasstab, kühlen Sie ihn ab, indem Sie den Stab mit dem Agar vom Inokulum weg berühren, und verteilen Sie die Flüssigkeit sofort auf der Agaroberfläche. Bitte beachten Sie, dass eine Verzögerung der Ausbreitung zu einem bakteriellen Überwachsen an der Stelle der Impfung führen kann.
Setzen Sie die Beschichtung jeder Verdünnungsreihe für alle 9 Zeitpunktkulturen fort und sterilisieren Sie den Glasverteilungsstab zwischen jeder Verdünnungsreihe flammsterilisierend.
Sobald die Platten einige Minuten trocknen gelassen wurden, kehren Sie um und legen Sie sie über Nacht in den 37 °C Inkubator. Nach dieser Wachstumsphase können Platten bei 4 °C gelagert werden.,
Untersuchen Sie die Verdünnungsplatten nach der Inkubation über Nacht auf Kontamination und Gleichmäßigkeit der Kolonien. Wählen Sie für jede Zeitpunktkultur eine Verdünnung, für die es zwischen 30-300 Kolonien pro Platte gibt. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder der Dreifachplatten für diese Verdünnung.
Berechnen Sie unter Verwendung der mittleren Anzahl von Kolonien für jede Verdünnung und des Verdünnungsfaktors die Konzentration von Bakterien in der ursprünglichen Kultur zu jedem Zeitpunkt in KBE/ml. Zum Beispiel, wenn es im Durchschnitt 30 Kolonien aus dem Triplikatplattensatz gibt, der von 0 erhalten wird.,1 ml der 10-4, oder 1-in-10.000, Verdünnung, dann gäbe es 30 geteilt durch 0,1 ml multipliziert mit 10.000 oder 3 Millionen KBE/ml.
Zeichnen Sie unter Verwendung der für jeden Zeitpunkt berechneten Bakterienkonzentration ein Diagramm des Basis-10-Protokolls der Bakterienkonzentrationen in KBE / ml gegen die Zeit in Stunden. Identifizieren Sie aus dem Diagramm die Log-Wachstumsphase der ursprünglichen Bakterienkultur und wählen Sie zwei der Zeitpunkte innerhalb der Log-Phase aus, wobei Sie den ersten dieser Zeitpunkte als t = 0 bezeichnen., Berechnen Sie die mittlere Erzeugungszeit unter Verwendung der Gleichung X gleich 2 bis zur Potenz von n multipliziert mit X0, wobei X die Anfangskonzentration zum Zeitpunkt t ist, X0 die Anfangskonzentration bei t = 0 ist und n die Anzahl der Generationen ist, die zwischen den beiden Zeitpunkten verstrichen sind.
Angenommen, X0 ist 1.000 KBE/ml und bei t = 6 h beträgt die Konzentration 16.000 KBE / ml. Unter Verwendung der Gleichung erhalten wir, dass 4 Generationen innerhalb von 6 h aufgetreten sind, was eine Erzeugungszeit von 6 dividiert durch 4 oder 1,5 h pro Generation ergibt.,
Die Messung der Bakterienwachstumskinetik ist für viele Anwendungen in Forschung, Landwirtschaft oder Bioengineering von grundlegender Bedeutung.
Eine Verwendung zur Kenntnis der Bakterienwachstumsrate besteht darin, eine genaue Menge einer Bakterienkultur zu erhalten, um eine andere Kultur oder ein anderes Medium zu impfen. Zum Beispiel müssen bestimmte Kulturen, wie Hülsenfrüchte, mit symbiotischen Bakterien, die als Rhizobie bekannt sind, angebaut werden, die die Wurzeln der Pflanzen besiedeln, um Knötchen zu bilden und Stickstoff zu „fixieren“ – Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak, das von der Pflanze verwendet werden kann., Für landwirtschaftliche Anwendungen wird eine bekannte Menge Rhizobia zu einem Torf-basierten Kohlenstoffmedium gegeben, das dann verwendet wird, um Hülsenfruchtsamen zu impfen, um die pflanzenbakterielle Symbiose herzustellen.
Die Wachstumsanalyse kann auch verwendet werden, um Bakterienarten zu identifizieren, die Industrieabfälle abbauen und möglicherweise wertvolle Nebenprodukte erzeugen können. In diesem Beispiel untersuchten die Forscher, wie Wachstumsmedien, die mit Schwarzlauge, einem Abfallprodukt aus der Holz-und Papierproduktion, ergänzt wurden, das Wachstum eines mikrobiellen Umweltisolats beeinflussten.,
Die Bakterien zeigten nicht nur ein verstärktes Wachstum mit schwarzer Flüssigkeit, sondern zeigten auch ein „diphasisches“ Wachstumsmuster, das auf das Vorhandensein von mehr als einer Kohlenstoffquelle in schwarzer Flüssigkeit hinweist, die die Bakterien metabolisieren können. Einzelne Bestandteile von Schwarzlauge könnten dann für eine detailliertere Wachstumsanalyse extrahiert werden.
Schließlich sind Messungen der Wachstumsrate auch nützlich, um Bakterien zu charakterisieren, die für bestimmte industrielle Zwecke entwickelt wurden, beispielsweise zur Beseitigung der Ölverschmutzung., Hier schufen Wissenschaftler gentechnisch veränderte Bakterienstämme, die Enzyme enthalten, um die Kohlenwasserstoffkomponenten von Öl abzubauen. Die Wachstumsanalyse wurde beispielsweise durchgeführt, um zu überprüfen, ob die technischen Bakterien in Gegenwart der toxischen Kohlenwasserstoffe eine höhere Wachstumsrate als normale Bakterien aufweisen, was auf eine verbesserte Toleranz hinweist, die es den technischen Bakterien ermöglicht, ihre Verschmutzungsreinigungsfunktion auszuführen.
Sie haben gerade Joves Video zur Analyse von Bakterienwachstumsraten mit Wachstumskurven gesehen., Sie sollten nun die verschiedenen Wachstumsphasen von Bakterienkulturen verstehen, wie Sie ein Experiment durchführen, um eine Wachstumskurve mithilfe der Zeitpunktsammlung und der seriellen Verdünnungsmethode zu erhalten, und wie die Wachstumsanalyse auf Forschungs-und industrielle Zwecke angewendet werden kann. Wie immer, danke fürs Zuschauen!
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