PMC (Polski)

dyskusja

zaproponowaliśmy, że wywołana alkoholem degeneracja entorhinal kory Piramidalnej neuronów i komórek ziarnistych w zębach u dorosłych szczurów, która występuje z powodu powtarzających się ataków ekspozycji i wycofania jest związana w znacznym stopniu z niesynaptycznym zjawiskiem obrzęku komórkowego (zwłaszcza glejowego)., Propozycja ta opierała się na tłumieniu zarówno obrzęku mózgu, jak i neurodegeneracji in vivo, a in vitro osiągnięto za pomocą moczopędnego furosemidu, silnego inhibitora Ko-transportu K+ – Cl (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998); niniejsze badanie dotyczy głównie ATZ oraz, w mniejszym stopniu, torasemidu i BUM., Wśród kluczowych wyników w niniejszym dokumencie są to, że kanały wodne AQP4 wydają się być regulowane przez neurotoksyczną ekspozycję na alkohol in vitro, oraz że ATZ, moczopędny lek pozbawiony siły przeciwutleniającej—w przeciwieństwie do furosemidu—a także silny inhibitor aktywności aqp4, hamuje obrzęk mózgu uzależniony od alkoholu i neurodegenerację in vitro i In vivo.,

aby zweryfikować potencjał przeciwutleniający furosemidu i określić, czy ATZ i torasemid posiadały podobne możliwości, wykorzystaliśmy test ORAC, powszechnie akceptowane standardowe narzędzie do pomiarów aktywności przeciwutleniającej w przemyśle farmaceutycznym i spożywczym (Huang et al., 2002). Podobnie jak wszystkie oceny przeciwutleniaczy, test ORAC ma swoje wady, ale jego zastosowanie rodników peroksylowych (lub hydroksylowych)jako pro-utleniaczy różni się od testów, które obejmują utleniacze, które niekoniecznie są pro-utleniaczami (Prior et al., 2005). Niemniej jednak, jak podkreślono w innych miejscach (Hamelink et al.,, 2005), z różnych powodów pojedynczy parametr aktywności przeciwutleniającej in vitro niekoniecznie przewiduje aktywność biologiczną in vivo.

w przypadku oceny in vitro neurotoksyczności alkoholu popijawowego, organotypowa kultura plastra HEC ma tendencję do powielania Regionalnego wzorca degeneracji mózgu obserwowanego in vivo, z pewnymi różnicami, takimi jak czasami wyraźne uszkodzenie CA1 i prawdopodobnie zaangażowanie NMDAR. Podejrzewamy, że różnice te są związane z wiekiem młodzieńczym plastrów HEC w kulturze (ogólnie 4 tygodnie życia) w stosunku do dorosłego mózgu, ale wymaga to dalszych badań., Niemniej jednak, zachowując wiele relacji neuron-glia i połączeń neuronalnych nienaruszonego dojrzewania mózgu, Kultury plasterka mózgu mają wyraźne zalety dla eksperymentów neurotoksyczności nad rozproszonymi (Zwykle płodowych) kulturami hipokampa lub kory (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Neurodegeneracja wywołana alkoholem w kulturach plastra mózgu wymaga na ogół podchronicznej ekspozycji na stężenia Zbliżające się do ∼100 mM, w połączeniu z wycofaniem (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Jednak takie stężenia nie są rzadkością w binging przewlekłych alkoholików (Lindblad i Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Oznaczanie neurodegeneracji w kulturach plastra stosowanych PI, istotną plamę, która etykietuje umierające neurony (vornov et al., 1991) i uwolnienie LDH, ogólna miara neurotoksyczności w kulturach plastra mózgu, która dobrze koreluje z etykietowaniem PI (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., W odniesieniu do warunków medialnych w naszych eksperymentach z plasterkiem mózgu, przyznajemy, że mogą one być hiperosmolarne w różnym stopniu podczas ekspozycji na alkohol (zgodnie z plazmą alkoholików podczas zatrucia (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), ale izosomalny w okresach karencji.

przechodząc do metodologii in vivo w tym raporcie, nasze wcześniejsze badania neurodegeneracji mózgu wywołanej alkoholem (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) wykorzystali oryginalne podejście do wywoływania napadów odstawienia alkoholu (Majchrowicz, 1975), które po raz pierwszy zauważono w celu promowania degeneracji neuronów piramidalnych w limbicznych (zwłaszcza entorhinal) regionach korowych i komórkach ziarnistych zębiny (Switzer et al., 1982). Wiązało się to z intubacją alkoholu trzy do czterech razy na dobę (9-12 g / kg / dobę) przez 4 dni w celu wytworzenia epizodycznie wysokich średnich wartości BAC (360-450 mg/dl), ale ze wskaźnikiem śmiertelności czasami zbliżającym się do 40%. Zmodyfikowaliśmy model do mniej ciężkiego leczenia (Collins et al.,, 1998) pojedynczej dobowej intubacji alkoholowej (∼5 g/kg) przez 7-10 dni, uzyskując średnie wartości BAC 2-h w wysokości ∼250 mg/dl—nadal uważane za klinicznie ciężkie zatrucie (Lowenstein et al., 1990) – i niższy (∼20%) wskaźnik śmiertelności; Modyfikacja ta została tu zastosowana z ATZ. Fakt, że w tym badaniu dzienne i łączne wartości BAC 2-h nie różniły się między szczurami leczonymi alkoholem i alkoholem + ATZ (rys. 6A) eliminuje możliwość, że niższe stężenia alkoholu w mózgu mogą wyjaśniać działanie przeciwwymiotne i neuroprotekcyjne leku moczopędnego.,

mniej dotkliwy pojedynczy dobowy podchroniczny binge generuje regionalne dystrybucje degeneracyjnych (argyrofilowych) neuronów, które są nieodróżnialne od—ale mniej intensywne niż w oryginalnej procedurze Majchrowicza (1975). Hamowanie NMDAR w żadnym z protokołów zatrucia nie powoduje istotnej neuroprotekcji. Stopień wywołanego obrzęku mózgu jest podobny w obu modelach binge; pod tym względem wzrost wody w mózgu na rysunku 6B, chociaż pozornie niski procent (∼0,6%), reprezentuje prawie 2,5% obrzęk mózgu (Elliott and Jasper, 1949)., Krótko mówiąc, nic nie wskazuje na to, że pierwotna procedura zatrucia Majchrowicza i jego modyfikacja raz na dobę różnią się mechanizmami komórkowymi odpowiedzialnymi za obrzęk mózgu wywołany alkoholem i neurodegenerację.

równocześnie z hamowaniem neurodamagu, furosemid tłumił obrzęk mózgu u dorosłych szczurów z powodu powtarzającego się zatrucia / odstawienia raz na dobę-efekt zgodny z blokadą działania moczopędnego Ca2+—niezależny od astroglial obrzęk w epileptogennych plastrach hipokampa (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), ani nie towarzyszył mu zwiększony NMDAR mózgu, jak stwierdzono z wiązaniem MK-801 (Rudolph et al., 1997), dalej argumentują przeciwko wybitnemu mechanizmowi pobudzającemu. Jest to nadal możliwe, jak sugerują badania jonotropowych receptorów glutaminianu u alkoholików (Preuss et al., 2006) i recenzowane przez innych (Tsai i Coyle, 1998), że nadmierna transmisja glutaminergiczna może być zaangażowana w napady odstawienia alkoholu i zaburzoną aktywację autonomiczną., Jednak u dorosłych szczurów popijanych alkoholem gęstość neurodegeneracji osiąga maksimum znacznie wcześniej niż czas największej aktywności napadowej (Majchrowicz, 1975) i nie zwiększa się w ciągu 36–godzinnego okresu odstawienia (Collins et al., 1996)—sugerując, że skłonność do napadów padaczkowych i neurodamage nie są ze sobą bezpośrednio powiązane.

Tabela 1 podsumowuje wpływ trzech leków moczopędnych na działanie alkoholu popijającego in vitro i / lub in vivo i kontrastuje te wyniki z ich potencjałem antyoksydacyjnym., Uwzględniono nasze wyniki hodowli krojenia HEC, jak również zgłoszone badania In vivo z BUM i L-644, 711. Zawiera również zgłoszone wyniki z kilkoma przeciwutleniaczami, do których już nawiązano, które zostaną omówione poniżej. Testy ORAC potwierdziły, że furosemid jest skutecznym przeciwutleniaczem, co najmniej równoważnym z Troloxem związanym z witaminą E. Na podstawie aktywności furosemidu, a także pozytywnych wyników z kilkoma uznanymi przeciwutleniaczami i negatywnych wyników z L-644, 711 i BUM, Hamelink et al., (2005) zasugerował, że ochrona furosemidu może być bardziej związana z jego właściwościami przeciwutleniającymi niż z redukcją obrzęków. Podkreślamy jednak, że we wspomnianym badaniu nie przeprowadzono oceny potwierdzającej obrzęk mózgu. Na przykład, jeśli stwierdzono, że obrzęk mózgu wywołany alkoholem nie ma wpływu in vivo przez L-644, 711 lub BUM z powodu bariery krew-mózg, metabolizmu lub innych powodów, Hamelink et al. (2005) wnioski wymagałyby, naszym zdaniem, rewizji. I do tego momentu BUM nie zapobiegł obrzękom w plastrach HEC-narażonych na działanie alkoholu (rys. 5C)., Ponadto, gdyby mechanizm inny niż odstraszanie obrzęków (taki jak wychwytywanie wolnych rodników) był głównym neuroprotekcyjnym stosowanym przez furosemid, spodziewano się, że środek moczopędny znacznie zmniejszy neurodamage wywołany przez alkohol we wszystkich dotkniętych regionach, ale nie udało się tego zrobić w kłębuszkach węchowych żarówki (Collins et al., 1998), region Nie zbadany przez Hamelink et al. (2005).,

Tabela 1 podsumowuje również, że pomimo braku zdolności antyoksydacyjnych, ATZ moczopędny, głównym celem tych obecnych eksperymentów, zapobiegał nagromadzeniu wody tkankowej wywołanej alkoholem i neurodegeneracji zarówno w kulturach plastra HEC i In vivo. Inhibitor anhydrazy węglanowej i stymulator rozszerzający mózg (Settakis et al., 2003), ATZ odnotowano zmniejszenie niedokrwiennego obrzęku mózgu u szczurów (Czernicki et al., 1994), ale najwyraźniej nie ma dalszych informacji łączących diuretyk z możliwą neuroprotekcją., Ponadto, a szczególnie germane do naszych eksperymentów alkoholowych, wykazano, że ATZ i kilka izomerów arylsulfonamidu silnie hamują kanał wodny AQP4 (Huber et al., 2007); możliwe znaczenie tego efektu omówiono poniżej.

torasemid, związek na bazie sulfonylomocznika, który jest uważany za silniejszy diuretyk pętlowy niż furosemid, ale zgodnie z wynikami ORAC, nie ma zdolności antyoksydacyjnej, odniósł pewien sukces jako środek neuroprotekcyjny w modelach udaru/obrzęku (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Selektywnie hamuje również obrzęk glejowy związany z transportem Cl, łagodząc zależny od kwasicy, ale nie zewnątrzkomórkowy wzrost objętości komórek wywołany glutaminianem (Staub et al., 1993). W naszych kulturach plastra HEC torasemid w dużej mierze blokował uwalnianie LDH wywołane ekspozycją / odstawieniem alkoholu. Chociaż torasemid może chronić poprzez inne mechanizmy molekularne, takie jak blokowanie dróg przemian receptora angiotensyny/angiotensyny (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001), wynik jest zgodny z poglądem, że nadmierne uwodnienie tkanki mózgowej i jej skutki uboczne są potencjalnie ważnymi czynnikami w mechanizmie neurotoksycznym alkoholu.

6) i In vivo (Hamelink et al., 2005) wskazuje, że związek, który przede wszystkim hamuje wymianę Cl- / HCO3, może nie skutecznie przeciwdziałać wywołanemu alkoholem wzrostowi wody w mózgu., Chociaż brakuje wystarczającej próbki do badań in vivo alkohol/obrzęk, zauważamy, że w modelu udaru u szczurów, L-644, 711 był nieskuteczny w zmniejszaniu obrzęku mózgu (Cole et al., 1991). W odniesieniu do BUM, w harmonii z wynikami in vivo Hamelink et al. (2005), ten środek moczopędny nie chronił przed hiperglikemią alkoholową w modelu HEC slice culture. Ponadto wykazaliśmy, że w przeciwieństwie do ATZ i furosemidu, nie zapobiegł on obrzękom wywołanym przez alkohol, co prawdopodobnie wyjaśniało jego brak neuroprotekcji., Niektóre rozważania, które mogą u tego leżeć, to fakt, że BUM jest znacznie słabszy niż furosemid pod względem hamowania transportera CL – – ekstrudującego kcc2, ale jest 500-krotnie silniejszym inhibitorem współportera elektroneutralnego na+-K+-2CL− (Nkcc1) (Payne et al., 2003). Uważa się, że ta różnica w sile działania leży u podstaw opisanego przez BUMA braku działania przeciwpadaczkowego w porównaniu z hamowaniem przez furosemid aktywności padaczkowej indukowanej K+w plasterkach hipokampa (Margineanu i Klitgaard, 2006)., Jest zatem możliwe, że ta rozbieżność między BUM i furosemidem jest również ważna w kontekście hamowania/zapobiegania obrzękom mózgu wywołanym alkoholem i neurodegeneracji.

Jego zapobieganie obrzękom mózgu wywołanym alkoholem (Collins et al.,, 1998) może po raz pierwszy wynikać z silnego hamowania Ko-transportera kcc2 specyficznego dla mózgu, jak wspomniano, z przywróceniem komórkowej siły i objętości jonowej. Interesujące jest to, że zdarzenia apoptotyczne indukowane przez etopozyd w fibroblastach—translokacja cytozolowego białka BAX do mitochondriów i wynikające z tego uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c – zostały stłumione przez furosemid (Karpinich et al., 2002)., Wyjaśniono, że translokacja BAX jest wynikiem zmiany konformacyjnej w BAX wynikającej ze zmian jonowych i pH w środowisku cytozolowym, zmian, które furosemid może przeciwdziałać poprzez hamowanie wytłaczania Cl. Nawiasem mówiąc, czy Klasyczne zdarzenia apoptotyczne, takie jak uwalnianie cytochromu c, przyczyniają się znacząco do neurodegeneracji wywołanej alkoholem, nie jest pewne, ponieważ badanie na szczurach popijających alkoholem, wykorzystujących końcowy wskaźnik apoptozy, barwienie TUNELA, było w dużej mierze negatywne(Obernier et al., 2002)., Niemniej translokacja BAX i uwalnianie cytochromu c powinny być badane w modelach alkoholowych, ponieważ zdarzenia te mogą powstawać niezależnie od klasycznych mechanizmów apoptozy.

nie kwestionujemy jednak, że dodatkowy tryb działania furosemidu, który może przyczynić się do neuroprotekcji (i ewentualnie zmniejszenia obrzęku mózgu), może być również antyoksydacyjny., Stres oksydacyjny został postulowany przez nas i kilka innych jako fundamentalny dla neurotoksycznego mechanizmu alkoholu; rzeczywiście, jak pokazano w tabeli 1, podawanie wybranych przeciwutleniaczy (zwłaszcza kanabidiolu, witaminy E i butylohydroksytoluenu)zapewniło znaczącą neuroprotekcję u szczurów popijających alkoholem (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), ale źródła reaktywnych form tlenu (ROS. Inne potencjalne działania furosemidu wydają się mniej istotne dla modeli alkoholowych., Podaje się, że diuretyk jest antagonistą receptora GABA-A w stężeniach podobnych do stosowanych w kulturach HEC, ale antagonizm objawia się przede wszystkim w móżdżku, a nie w hipokampie i korze (Korpi i Luddens, 1997).

kluczowym punktem jest to, że nasze wstępne odkrycie zwiększonego AQP4 podczas obrzęku wywołanego alkoholem i neurodegeneracji w plasterkach HEC może mieć nowe znaczenie w kategoriach mechanizmu opartego na obrzękach alkoholowych. Rodzina kanałów wodnych aquaporin składa się z kilku produktów genowych, z AQP4 podstawową formą w mózgu (Gunnarson et al.,, 2004). Chociaż wyrażona głównie w astroglii (Amiry-Moghaddam et al., 2003), jest również wyrażona przez mikroglej aktywowany przez bodźce zapalne (Tomas-Camardiel et al., 2004). Rosnące dowody wskazują, że aktywność AQP4 odgrywa rolę pobudzającą w komórkowym (cytotoksycznym) obrzęku glejowym w zwierzęcych modelach urazów, udarów i niedokrwienia (Taniguchi et al., 2000; Badaut i in., 2007; Neal et al., 2007). Chociaż dokładny charakter (tj.,, cytotoksyczne a wazogenne) obrzęku zależnego od alkoholu jest nadal niepewne, podejrzewamy, że obrzęk glejowy jest ważnym składnikiem, a AQP4 może zatem odgrywać wczesną rolę neuropatologiczną. Jednak nadal możliwe jest, że podwyższenie aqp4 jest komórkową odpowiedzią na obrzęk i związane z nim reakcje neuroinflacyjne, a nie (lub dodatkowo) krokiem sprawczym. Na przykład wzrost liczby genów śmierci / przeżycia komórek, w tym AQP4, był związany z niedokrwienną neuroprotekcją spowodowaną zapalnym (endotoksyną) kondycjonowaniem mózgu (Mallard and Hagberg, 2007)., Aby odpowiedzieć na to pytanie, potrzebne są badania z modelami knockdown lub knockout.

nasz obecny pogląd jest taki, że niezależnie od procesu molekularnego, który jest inicjowany, obrzęk mózgu (częściowo cytotoksyczny) i związana z nim deformacja stresu komórkowego z powodu powtarzalnej wysokiej ekspozycji na alkohol i odstawienia promuje procesy prozapalne obejmujące aktywację PLA2 i nadmierną mobilizację AA, ze zwiększonym stresem oksydacyjnym jako jednym z dalszych wyników (Lehtonen and Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Praca załóg i in. (2004) sugeruje, że zwiększone ilości cytokin prozapalnych (np.,, TNFa). Podczas gdy wewnątrzkomórkowe zwiększenie ROS z powodu stresu alkoholowego/alkoholowego i obrzęku komórkowego może wynikać z wielu dróg oprócz PLA2 (np. cytochromy P450, oksydaza ksantynowa, reduktaza rybonukleotydowa, oksydaza NADPH i wyciek mitochondrialny), AA jest czasami głównym czynnikiem w neurodegeneracyjnym procesie ROS (Bobba et al., 2008). AA może wytwarzać stres oksydacyjny enzymatycznie i nieenzymatycznie (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004), a także pośrednio poprzez indukcję oksydazy NADPH (Dana et al.,, 1998); może również zaostrzyć obrzęk (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Ponadto ROS mogą być dodatnimi sygnałami sprzężenia zwrotnego, dodatkowo aktywując izoformy PLA2 (Martinez and Moreno, 2001). Prawdopodobnie różni się od generacji ROS, AA może napędzać procesy śmierci ogniw poprzez stymulowanie przejścia przepuszczalności mitochondrialnej (Scorrano et al., 2001). Glutaminian, uwalniany przez obrzęk astrocytowy, a także przez AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg and Mongin, 1998), może nasilać stres oksydacyjny poprzez Nie-ekscytotoksyczny szlak obejmujący hamowanie biosyntezy glutationu (toksyczność oksydacyjnego glutaminianu (Tan et al., 2001). Warto zauważyć, że nasze obecne badania inhibitorów z kulturami plastra HEC wskazują, że blokada aktywności PLA2 jest neuroprotekcyjna wobec leczenia alkoholowego (Brown et al., 2008)., Jednak kolejną mechanistyczną możliwością jest potencjalna integracyjna rola uzależnionego od alkoholu neurodamage dla czynnika jądrowego kappa B (NF-kB), neuroinflammacyjnego czynnika transkrypcyjnego, który jest raportowany jako regulowany przez wielonienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak AA (Maziere et al., 1999), a także przez alkohol w kulturach i upijanie się alkoholem in vivo (Zima i Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou and Crews, 2006).,

podsumowując, ponieważ dwa leki moczopędne, które nie mają siły przeciwutleniającej, ATZ i torasemid, zapobiegają obrzękowi mózgu i neurodegeneracji wywołanej alkoholem, argumentujemy, że obrzęk mózgu może być krytycznym czynnikiem prowadzącym do neurodegeneracji, z jego tłumieniem przez te leki moczopędne, a także przez furosemid (ale nie przez BUM lub ewentualnie L–644, 711) zapewniający znaczącą neuroprotekcję. Niemniej jednak, dodatkowe mechanizmy ochronne mogą istnieć dla każdego z skutecznych czynników., Również kanały wodne AQP4, ewidentnie zwiększone przez alkohol, mogą być ważne w generowaniu lub utrzymaniu obserwowanego obrzęku. Potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć mechanizmy, dzięki którym powtarzające się zatrucie alkoholowe i odstawienie promują obrzęk mózgu oraz w jaki sposób/czy AQP4 jest zaangażowany centralnie.