PMC (Dansk)

Diskussion

Vi har foreslået, at alkohol-betingede degeneration af entorhinal kortikale pyramideformede nerveceller og dentate granula celler i voksne rotter, der opstår på grund af gentagne anfald af eksponering og tilbagetrækning er knyttet til en betydelig omfang, nonsynaptic cellulære (især glial) hævelse fænomener., Dette forslag var baseret på undertrykkelse af både hjerne ødem og neurodegeneration in vivo og in vitro blev opnået med vanddrivende furosemid, en potent K+-Cl− co-transport-hæmmer (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998); den nuværende undersøgelse vedrører hovedsageligt at.og i mindre grad torasemide og BUM., Blandt de vigtigste resultater heri er, at AQP4 vand kanaler, der synes at være upregulated af neurotoksiske binge alkohol eksponering in vitro, og at ATZ, et diuretikum mangler antioxidant potens—i modsætning til furosemid—og også en potent inhibitor af AQP4 aktivitet, undertrykker binge alkohol–afhængige hjerne ødem og neurodegeneration in vitro og in vivo.,

for At kontrollere, furosemid er antioxidant potentiale og til at afgøre, om eller ikke ATZ og torasemide besad lignende kapaciteter, vi har udnyttet den ORAC-analysen er en alment accepteret standard-værktøj for antioxidant aktivitet målinger i medicinal-og fødevareindustrien (Huang et al., 2002). Ligesom alle antioxidant skøn, ORAC-analysen har sine mangler, men dets brug af peroxyl (eller hydroxyl) radikaler, som pro-oxidanter, der gør det anderledes fra analyser, der involverer oxidanter, der ikke nødvendigvis er pro-oxidanter (Før et al., 2005). Ikke desto mindre, som understreget andetsteds (Hamelink et al.,, 2005), af forskellige årsager forudsiger en enkelt in vitro parameter af antio .idantaktivitet ikke nødvendigvis biologisk aktivitet in vivo.

Til in vitro-vurderinger af binge alkohol neurotoksicitet, den organotypisk HEC skive kultur har en tendens til at gentage den regionale hjernens degeneration mønster, der er observeret i vivo, med nogle forskelle, som undertiden indlysende CA1 skader og eventuelt NMDAR engagement. Vi formoder, at disse forskelle er relateret til den unge alder af HEC-skiverne i kultur (4 4 ugers alder samlet) i forhold til voksen hjerne, men dette kræver yderligere undersøgelse., Ikke desto mindre, i at bevare meget af neuron-glia relationer og neuronal tilslutning af intakt modning af hjernen, hjernen skive kulturer har forskellige fordele for neurotoksicitet eksperimenter over spredte (normalt føtal) hippocampus eller kortikale kulturer (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Alkoholinduceret neurodegeneration i hjernekulturer har generelt krævet subkronisk eksponering for koncentrationer, der nærmer sig 100 100 mM, kombineret med tilbagetrækninger (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Sådanne koncentrationer er imidlertid ikke ualmindelige hos binging kroniske alkoholikere (Lindblad og Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Bestemmelse af neurodegeneration i skivekulturerne anvendte PI, en vital plet, der mærker døende neuroner (Vornov et al ., 1991) og LDH-frigivelse, et generelt mål for neurotoksicitet i hjerneskærekulturer, der korrelerer godt med PI-mærkning (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., Med hensyn til medieforhold i vores hjerneskæreeksperimenter anerkender vi, at de sandsynligvis vil være hyperosmolære i varierende grad under alkoholeksponeringen (i overensstemmelse med alkoholikernes plasma under forgiftning (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), men iso – osmolar i tilbageholdelsesperioder.

Med hensyn til in vivo–metoden i denne rapport, vores tidligere binge-alkoholinducerede hjerne-neurodegenerationsundersøgelser (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) har udnyttet den oprindelige tilgang til fremkalde alkohol tilbagetrækning anfald (Majchrowicz, 1975), der først blev noteret for at fremme degeneration af pyramideformet neuroner i det limbiske (især entorhinal) kortikale regioner og granula celler af dentate gyrus (Switzer et al., 1982). Dette medførte alkoholintubationer tre til fire gange dagligt (9-12 g/kg/dag) i en 4-dages varighed for at generere episodisk høje gennemsnitlige BAC-værdier (360-450 mg/dl), men med en dødelighed, der undertiden nærmer sig 40%. Vi ændrede modellen til en mindre alvorlig behandling(Collins et al .,, 1998) af en enkelt daglig alkohol intubation (∼5 g/kg) i 7-10 dage, svarende til gennemsnitlig 2-h BAC værdier ∼250 mg/dl—stadig betragtes som klinisk alvorlig forgiftning (Lowenstein et al., 1990)—og lavere (20 20%) dødelighed; denne ændring blev brugt her med at.. Det faktum, at de daglige og samlede 2-h BAC-værdier i denne undersøgelse ikke adskiller sig mellem alkohol-og alkohol + at. – behandlede rotter (fig. 6A) undgår muligheden for, at lavere hjernealkoholkoncentrationer kan forklare diuretikumets anti-edemiske og neuroprotektive handlinger.,

De mindre alvorlige enkelt daglig subkroniske binge genererer regionale fordelinger af udarter (argyrophilic) neuroner, der ikke kan skelnes fra—men mindre intens end dem, der er i den oprindelige Majchrowicz (1975) procedure. Ingen signifikant neuroprotektion opnås ved NMDAR-hæmning i nogen af forgiftningsprotokollerne. Graden af induceret hjerneødem er ens i begge binge-modeller; i den henseende stiger hjernevand i figur 6B, skønt en tilsyneladende lav procentdel (0.6 0.6%) repræsenterer næsten 2.5% hjerne hævelse (Elliott og Jasper, 1949)., Kort sagt er der ingen tegn på, at den oprindelige majchro .ic.-forgiftningsprocedure og dens en gang dagligt modifikation adskiller sig i de cellulære mekanismer, der er ansvarlige for alkoholinduceret hjerneødem og neurodegeneration.

Samtidig med at hæmme neurodamage, furosemid undertrykt hjerne ødem i voksne rotter på grund af gentagne gang dagligt forgiftning/tilbagetrækning—en effekt, der er i overensstemmelse med den vanddrivende ‘ s blokade af Ca2+-uafhængig astroglial hævelse i epileptogenic hippocampus skiver (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), og det blev heller ikke ledsaget af øget hjerne-NMDAR som konstateret med MK-801-binding (Rudolph et al., 1997), argumenterer yderligere mod en fremtrædende e .citotoksisk mekanisme. Det er stadig muligt, som foreslået af undersøgelser af ionotrope glutamatreceptorer hos alkoholikere (Preuss et al., 2006) og gennemgået af andre (Tsai og Coyle, 1998), at overdreven glutamatergisk transmission kunne være involveret i anfald af tilbagetrækning af alkohol og forstyrret autonom aktivering., Men i binge alkohol–berusede voksne rotter, tætheden af neurodegeneration når en maksimal betydeligt tidligere end det tidspunkt, største beslaglæggelse aktivitet (Majchrowicz, 1975) og ikke stigning på hele 36-h fortrydelsesfristen (Collins et al., 1996) – hvilket antyder, at anfaldstilbøjelighed og neurodamage ikke er direkte relateret.

tabel 1 opsummerer virkningerne af de tre diuretika på binge-alkoholvirkninger in vitro og / eller in vivo og kontrasterer disse fund med deres antio .idantpotentialer., Vores HEC skive kultur resultater samt de rapporterede in vivo undersøgelser med BUM og L-644, 711 er inkluderet. Det indeholder også rapporterede resultater med flere antio .idanter, der allerede er nævnt, hvilket vil blive diskuteret nedenfor. ORAC-analyserne bekræftede, at furosemid er en effektiv antio .idant, der i det mindste er ækvipotent med den vitamin E–relaterede trolo.. Baseret på furosemid aktivitet, såvel som positive resultater med flere etablerede antioxidanter og negative resultater med L-644, 711, og BUM, Hamelink et al., (2005) foreslog, at furosemids beskyttelse kunne være tættere forbundet med dets antio .idantegenskaber end med ødemreduktion. Vi understreger dog, at der ikke blev foretaget nogen bekræftende hjerneødem-vurderinger i ovennævnte undersøgelse. For eksempel, hvis binge–alkoholinduceret hjerneødem havde vist sig at være upåvirket in vivo af L-644, 711 eller BUM af blod-hjerne-barriere, metabolisk eller andre årsager, Hamelink et al. (2005) konklusionerne vil efter vores mening kræve revision. Og til det punkt undlod BUM at forhindre ødemer i HEC-skiver binge-udsat for alkohol (Fig. 5C)., Hertil kommer, at hvis en mekanisme, som andre end ødem afskrækkende virkning (såsom gratis radikal fældefangst) var den vigtigste neuroprotektive en ansat af furosemid, de vanddrivende ville have været forventes at reducere overspisning og alkohol–induceret neurodamage i alle de berørte regioner, men undlod det for at gøre det i den olfaktoriske pære glomeruli (Collins et al., 1998), en region, der ikke blev undersøgt af Hamelink et al. (2005).,

Tabel 1 opsummerer, at der, til trods for den manglende antioxidant kapacitet, ATZ vanddrivende, det primære fokus for disse aktuelle eksperimenter, som forhindrede, at binge alkohol–induceret væv vand ophobning og neurodegeneration både i HEC skive kulturer og in vivo. En kulsyreanhydrasehæmmer og cerebrovaskulær dilatatorstimulus (Settakis et al., 2003), er at.rapporteret at reducere iskæmisk hjerneødem hos rotter (C .ernicki et al., 1994), men der er tilsyneladende ingen yderligere oplysninger, der forbinder diuretika med mulig neuroprotektion., Desuden og især germane til vores alkoholeksperimenter har AT.og flere arylsulfonamidisomerer vist sig at hæmme a .p4-vandkanalen (Huber et al., 2007); den mulige betydning af denne effekt diskuteres yderligere nedenfor.

Torasemide, et sulfonylurea-baseret stof, der betragtes som en mere potent loop-diuretikum end furosemid, men ifølge ORAC resultater, har ingen antioxidant evne, har haft en vis succes som en sygdomsdæmpende agent i streg/ødem modeller (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Det hæmmer også selektivt Cl-transportrelateret glial hævelse, dæmpende acidose-afhængig, men ikke ekstracellulært glutamat-fremkaldt cellevolumen øges (Staub et al., 1993). I vores HEC-skivekulturer blokerede torasemide stort set LDH-frigivelsen fremkaldt af eksponering/tilbagetrækning af binge-alkohol. Selv om torasemide kan beskytte gennem andre molekylære mekanismer, såsom blokering af angiotensin/angiotensin receptor veje (Fortuno et al., 1999; Muni 1999 et al.,, 2001), er resultatet i overensstemmelse med synspunktet om, at hjernevæv overhydrering og dets nedstrøms virkninger er potentielt vigtige faktorer i alkoholens neurotoksiske mekanisme.

manglen på L-644, 711 til beskyttelse mod binge alkoholinduceret neurotoksicitet i HEC–skivekulturerne (fig. 6) og in vivo (Hamelink et al ., 2005) indikerer, at forbindelsen, der primært hæmmer Cl−/HCO3− udveksling, muligvis ikke effektivt modvirker de binge–alkoholinducerede hjernevandstigninger., Selvom der mangler tilstrækkelig prøve til in vivo-binge-alkohol/ødemundersøgelser, bemærker vi, at L-644, 711 i en slagmodel hos rotter var ineffektiv til at reducere hjerneødem (Cole et al., 1991). Med hensyn til BUM, i harmoni med In vivo-resultaterne af Hamelink et al. (2005), dette diuretikum beskyttede ikke mod binge alkohol neurodamage i HEC skive culture model. Vi viste endvidere, at I modsætning til at.og furosemid, blev HEC skive ødem induceret af binge alkohol ikke forhindret af dette diuretikum, hvilket muligvis forklarede dets mangel på neuroprotektion., Nogle overvejelser, der kan ligge til grund for dette er, at NUMSEN er betydeligt mindre potent end furosemid i form af hæmning af Cl− -strengpresning KCC2 transporter, men er en 500 gange stærkere inhibitor af electroneutral Na+-K+-2 cl− (NKCC1) co-transporter (Payne et al., 2003). Denne forskel i kræfter der menes at ligge til grund for BUM er rapporteret mangel af anti-epileptiske effekter i forhold til furosemid ‘ s hæmning af K+-induceret epileptiform aktivitet i hippocampus skiver (Margineanu og Klitgaard, 2006)., Det er derfor muligt, at denne divergens mellem BUM og furosemid også er vigtig i forbindelse med hæmning/forebyggelse af alkoholinduceret hjerneødem og neurodegeneration.ved at revidere spørgsmålet om furosemid og dets effektivitet kan diuretikumets neuroprotektive virkning mod binge–alkoholinduceret skade således opstå fra en kombination af handlinger, der ikke er tilgængelige for BUM eller L-644, 711. Dens forebyggelse af alkoholinduceret hjerneødem (Collins et al .,, 1998) kunne først stamme fra diuretikumets potente hæmning af den hjernespecifikke KCC2-co-transporter som nævnt med resulterende restaurering af cellulær ionstyrke og volumen. Af interesse er, at apoptotic begivenheder fremkaldt af etoposide i fibroblaster—de translokation af cytosolic BAX protein til mitokondrierne, og den deraf følgende frigivelse af mitokondrie-cytochrom c—blev undertrykt af furosemid (Karpinich et al., 2002)., Forklaringen var, at BAX translokation, er resultatet af en konformationelle ændringer i BAX som følge af ioniske og pH ændringer i cytosolic miljø, vil ændringer, som furosemid kunne imødegå via hæmning af Cl− ekstrudering. Parentes, uanset om klassisk apoptotic begivenheder såsom cytochrom c udgivelse bidrage væsentligt til alkohol-induceret neurodegeneration er usikker, som en undersøgelse i binge alkohol–beruset rotter ved hjælp af en terminal indikator for apoptose, TUNEL farvning, var overvejende negative (Obernier et al., 2002)., Ikke desto mindre bør Ba. – translokation og cytokrom C-frigivelse undersøges i binge-alkoholmodellerne, da disse begivenheder kan opstå uafhængigt af klassiske apoptosemekanismer.

Vi sætter imidlertid ikke spørgsmålstegn ved, at yderligere tilstand af furosemidvirkning, der kan bidrage til neuroprotektion (og muligvis reduktion af hjerneødem), kunne være antio .idativ., Oxidativt stress har været postuleret af os, og flere andre, som er grundlæggende for alkohol er neurotoksiske mekanisme; det er faktisk, som vist i Tabel 1, administrationen af udvalgte anti-oxidanter (især cannabidiol, E-vitamin, og butylhydroxytoluen), forudsat betydelige neuroprotection i binge alkohol–beruset rotter (Hamelink et al., 2005; CRE .s et al., 2006), men kilderne til reaktive iltarter (ROS) forstås upræcist. Andre potentielle virkninger af furosemid synes at være mindre relevante for alkoholmodellerne., Den diuretiske er rapporteret at være en GABA-A-receptor antagonist i koncentrationer, der svarer til dem, der anvendes i HEC skive kulturer, men antagonisme, der manifesterer sig primært i lillehjernen og ikke i hippocampus og cortex (Korpi og Luddens, 1997).

et vigtigt tilknyttet punkt er, at vores foreløbige fund af øget a .p4 under binge–alkoholinduceret ødem og neurodegeneration i HEC-skiver kan være af ny betydning med hensyn til alkoholens ødembaserede mekanisme. Aquaporin vand-kanal familie består af flere genetiske produkter, med AQP4 den primære form i hjernen (Gunnarson et al.,, 2004). Mens udtrykt primært i astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), udtrykkes det også af mikroglia aktiveret af inflammatoriske stimuli (Tomas-Camardiel et al., 2004). Stigende bevis tyder på, at a .p4-aktivitet spiller en anstiftende rolle i cellulært (cytotoksisk) glialødem i dyremodeller af traumer, slagtilfælde og iskæmi (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Selvom den præcise karakter (dvs .,, cytotoksisk versus vasogen) af det binge–alkoholafhængige ødemer er stadig usikkert, vi formoder, at glialødem er en vigtig komponent, og A .p4 kunne således have en tidlig neuropatologisk rolle. Det er dog stadig muligt, at a .p4-forhøjelse er et cellulært overlevelsesrespons på ødemet og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner snarere end (eller i tillæg til) et årsagstrin. For eksempel var opregulering af et antal celledød/overlevelsesgener, herunder A .p4, forbundet med iskæmisk neuroprotektion på grund af inflammatorisk (endoto .in) hjerne konditionering (Mallard og Hagberg, 2007)., Undersøgelser med knockdo .n eller knockout modeller er nødvendige for at besvare dette spørgsmål.

Vores nuværende opfattelse er, at en hvilken som helst molekylær proces er indledt, hjerne ødem (i en del cytotoksiske) og tilknyttede celle stress deformation på grund af gentagne høj alkohol eksponering og inddragelse fremmer pro-inflammatoriske processer, der omfatter aktivering af PLA2 og overdreven mobilisering af AA, med øget oxidativ stress som en downstream-resultatet (Lehtonen og Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Arbejdet med besætninger et al. (2004) antyder, at øgede proinflammatoriske cytokiner (f (,, TNFa), kan også være involveret. Mens intracellulære ROS stigninger på grund af alkohol/alkohol tilbagetrækning stress og cellulære ødemer kan skyldes en række ruter i tillæg til PLA2 (fx, cytochromes P450, xanthin oxidase, ribonucleotide reduktase, NADPH oxidase, og mitokondrie-lækage), AA-nogle gange er den største bidragyder i en neurodegenerativ ROS proces (Bobba et al., 2008). AA kunne producere oxidativt stress enzymatisk og nonenzymatically (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) såvel som indirekte via NADPH o .idase-induktion (Dana et al.,, 1998); det kan også forværre ødemet (Chan et al., 1983; 1983inkler et al., 2000). Derudover kan ROS være positive feedbacksignaler, der yderligere aktiverer PLA2 isoformer (Martine.og Moreno, 2001). Muligvis adskilt fra ROS generation, AA kunne brænde celledød processer ved at stimulere mitokondrie permeabilitet overgang (Scorrano et al., 2001). Glutamat, frigivet af astrocytisk hævelse såvel som af AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg og Mongin, 1998), kan forværre oxidativt stress via en ikke-excitotoxic vej indebærer hæmning af glutathion biosynthesis (oxidativ glutamat toksicitet (Tan et al., 2001). Bemærk, at vores nuværende inhibitorundersøgelser med HEC-skivekulturer indikerer, at blokade af PLA2-aktivitet er neuroprotektiv mod binge-alkoholbehandling (bro .n et al., 2008)., Der er imidlertid en yderligere mekanisk mulighed er den potentielle integrerende rolle i alkohol-afhængige neurodamage for nuklear faktor kappa B (NF-kB), en neuroinflammatory-forbundet transskription faktor, som er rapporteret til at være upregulated af flerumættede fedtsyrer som AA (Maziere et al., 1999) såvel som ved alkohol i kulturer og binge alkoholforgiftning in vivo (Kalima og Kalousova, 2005; CRE .s et al., 2006; Crewsou og CRE andS, 2006).,

I sammendrag, da to diuretika, at manglende antioxidant potens, ATZ og torasemide, forebygge både hjerne ødem og binge alkohol–induceret neurodegeneration, argumenterer vi for, at hjerne ødem er sandsynligt, at være en kritisk faktor, der fører til neurodegeneration, med dets undertrykkelse af disse diuretika, samt af furosemid (men ikke med NUMSEN eller eventuelt L-644, 711), der yder væsentlige neuroprotection. Ikke desto mindre kunne der findes yderligere beskyttelsesmekanismer for hvert af de effektive midler., A .p4-vandkanaler, der åbenbart øges med binge-alkohol, kan også være vigtige i dannelsen eller vedligeholdelsen af det observerede ødem. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå de mekanismer, hvormed gentagen alkoholforgiftning og tilbagetrækning fremmer hjerneødem, og hvordan/om A .p4 er centralt involveret.