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discusión

hemos propuesto que la degeneración inducida por el alcohol de las neuronas piramidales corticales entorrinales y las células granulares dentadas en ratas adultas que ocurre debido a episodios repetitivos de exposición y abstinencia está relacionada en gran medida con fenómenos de inflamación celular no sináptica (especialmente glial)., Esta propuesta se basó en la supresión tanto del edema cerebral como de la neurodegeneración in vivo e in vitro con el diurético furosemida, un potente inhibidor de cotransporte K+-Cl (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998); el presente estudio se refiere principalmente a ATZ y, en menor medida, a torasemida y BUM., Entre los resultados clave en este documento están que los canales de agua AQP4 parecen estar regulados por la exposición neurotóxica al alcohol en exceso in vitro, y que ATZ, un diurético carente de potencia antioxidante—a diferencia de la furosemida—y también un potente inhibidor de la actividad AQP4, suprime el edema cerebral dependiente del alcohol en exceso y la neurodegeneración in vitro e in vivo.,

para verificar el potencial antioxidante de la furosemida y determinar si ATZ y torasemida poseían capacidades similares, utilizamos el ensayo ORAC, una herramienta estándar ampliamente aceptada para mediciones de actividad antioxidante en las industrias farmacéutica y alimentaria (Huang et al., 2002). Como todas las estimaciones de antioxidantes, el ensayo ORAC tiene sus deficiencias, pero su uso de radicales peroxil (o hidroxilo) como prooxidantes lo hace diferente de los ensayos que involucran oxidantes que no son necesariamente prooxidantes (Prior et al., 2005). Sin embargo, como se destacó en otros lugares (Hamelink et al.,, 2005), por una variedad de razones, un solo parámetro in vitro de la actividad antioxidante no necesariamente predice la actividad biológica in vivo.

para las evaluaciones in vitro de la neurotoxicidad del alcohol de borrachera, el cultivo organotípico de corte HEC tiende a replicar el patrón Regional de degeneración cerebral observado in vivo, con algunas diferencias, como el daño a veces evidente de CA1 y posiblemente la participación de NMDAR. Sospechamos que estas diferencias están relacionadas con la edad adolescente de los cortes de HEC en cultivo (4 4 semanas de edad en general) en relación con el cerebro adulto, pero esto requiere más estudio., Sin embargo, al retener gran parte de las relaciones neurona-glía y la conectividad neuronal del cerebro intacto en maduración, los cultivos de cortes cerebrales tienen ventajas distintivas para los experimentos de neurotoxicidad sobre los cultivos dispersos (generalmente fetales) de hipocampo o corticales (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). La neurodegeneración inducida por el Alcohol en cultivos de cortes cerebrales generalmente ha requerido exposición subcrónica a concentraciones cercanas a ∼100 mM, combinada con retiros (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Sin embargo, tales concentraciones no son infrecuentes en alcohólicos crónicos compulsivos (Lindblad y Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). La determinación de la neurodegeneración en los cultivos de corte utilizó PI, una tinción vital que etiqueta las neuronas moribundas (Vornov et al., 1991), y la liberación de LDH, una medida general de neurotoxicidad en cultivos de cortes cerebrales que se correlaciona bien con el etiquetado de PI (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., Con respecto a las condiciones de los medios en nuestros experimentos de cortes cerebrales, reconocemos que es probable que sean hiperosmolares en diversos grados durante la exposición al alcohol (consistente con el plasma de los alcohólicos durante la intoxicación (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), pero iso-osmolar durante los tiempos de espera.

volviendo a la metodología in vivo en este informe, nuestros estudios anteriores de neurodegeneración cerebral inducida por atracones de alcohol (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) utilizó el enfoque original para inducir convulsiones por abstinencia de alcohol (Majchrowicz, 1975) que se observó por primera vez para promover la degeneración de las neuronas piramidales en regiones corticales límbicas (especialmente entorrinales) y células granulares de la circunvolución dentada (Switzer et al., 1982). Esto implicó intubaciones de alcohol de tres a cuatro veces al día (9-12 g / kg / día) durante 4 días para generar valores promedio de ACB episódicamente altos (360-450 mg/dl), pero con una tasa de mortalidad a veces cercana al 40%. Modificamos el modelo a un tratamiento menos severo (Collins et al.,, 1998) de una sola intubación diaria de alcohol (∼5 g/kg) durante 7-10 días, produciendo valores promedio de 2-h BAC de 2 250 mg/dl—todavía considerado intoxicación clínicamente grave (Lowenstein et al., 1990)—y tasas de mortalidad más bajas (∼20%); Esta modificación se utilizó aquí con ATZ. El hecho de que en este estudio los valores diarios y agregados de 2-h BAC no difieran entre las ratas tratadas con alcohol y alcohol + ATZ (Fig. 6A) evita la posibilidad de que las concentraciones más bajas de alcohol en el cerebro puedan explicar las acciones antiedémicas y neuroprotectoras del diurético.,

la borrachera subcrónica diaria menos severa genera distribuciones regionales de neuronas degenerativas (argirófilas) que son indistinguibles de—pero menos intensas que—las del procedimiento original de Majchrowicz (1975). No se consigue una neuroprotección significativa mediante la inhibición del NMDAR en ninguno de los protocolos de intoxicación. El grado de edema cerebral inducido es similar en ambos modelos de atracones; en ese sentido, el aumento de agua cerebral en la figura 6B, aunque un porcentaje aparentemente bajo (0 0.6%), representa casi un 2.5% de hinchazón cerebral (Elliott y Jasper, 1949)., En resumen, no hay ninguna indicación de que el procedimiento original de intoxicación de Majchrowicz y su modificación una vez al día difieran en los mecanismos celulares responsables del edema cerebral inducido por el alcohol y la neurodegeneración.

concomitante con la inhibición del neurodamago, la furosemida suprimió el edema cerebral en ratas adultas debido a la intoxicación/abstinencia repetitiva una vez al día, un efecto consistente con el bloqueo diurético de la hinchazón astroglial independiente de Ca2+en cortes epileptogénicos del hipocampo (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), ni se acompañó de un aumento del NMDAR cerebral como se determinó con la unión a MK-801 (Rudolph et al., 1997), argumentan además en contra de un mecanismo excitotóxico prominente. Todavía es posible, como sugieren los estudios de receptores ionotrópicos de glutamato en alcohólicos (Preuss et al., 2006) y revisado por otros (Tsai y Coyle, 1998), que la transmisión glutamatérgica excesiva podría estar involucrada en convulsiones por abstinencia de alcohol y activación autonómica alterada., Sin embargo, en ratas adultas borrachas intoxicadas con alcohol, la densidad de neurodegeneración alcanza un máximo considerablemente antes del momento de mayor actividad convulsiva (Majchrowicz, 1975) y no aumenta a lo largo de un período de abstinencia de 36 horas (Collins et al., 1996)—sugiriendo que la propensión a las convulsiones y el neurodaño no están directamente relacionados.

La Tabla 1 resume los efectos de los tres diuréticos sobre los efectos del alcohol de borrachera in vitro y / o in vivo, y contrasta estos hallazgos con sus potenciales antioxidantes., Se incluyen nuestros resultados de cultivo de corte HEC, así como los estudios in vivo reportados con BUM y L-644, 711. También incluye los resultados reportados con varios antioxidantes ya aludidos, que se discutirán a continuación. Los ensayos de ORAC verificaron que la furosemida es un antioxidante eficaz, siendo al menos equipotente con el trolox relacionado con la vitamina E. En base a la actividad de la furosemida, así como los resultados positivos con varios antioxidantes establecidos y los resultados negativos con L-644, 711 y BUM, Hamelink et al., (2005) sugirieron que la protección de la furosemida podría estar más estrechamente asociada con sus propiedades antioxidantes que con la reducción del edema. Sin embargo, destacamos que no se realizaron evaluaciones confirmatorias de edema cerebral en el estudio antes mencionado. Por ejemplo, si se hubiera encontrado que el edema cerebral inducido por el alcohol en exceso no estaba afectado in vivo por L–644, 711 o BUM por barrera hematoencefálica, metabolismo u otras razones, Hamelink et al. (2005) conclusions would, in our opinion, require revision. Y hasta ese punto, BUM no pudo prevenir el edema en las rebanadas de HEC expuestas al alcohol (Fig. 5C)., Además, si un mecanismo que no sea la disuasión del edema (como el atrapamiento de radicales libres) fuera el principal neuroprotector empleado por la furosemida, se habría esperado que el diurético redujera significativamente el neurodaño inducido por el alcohol en todas las regiones afectadas, pero no lo hizo en los glomérulos del bulbo olfativo (Collins et al., 1998), una región no examinada por Hamelink et al. (2005).,

La Tabla 1 también resume que, a pesar de carecer de capacidad antioxidante, el diurético ATZ, el foco principal de estos experimentos actuales, previno la acumulación de agua tisular inducida por el alcohol y la neurodegeneración tanto en cultivos de corte HEC como in vivo. Un inhibidor de la anhidrasa carbónica y un estímulo dilatador cerebrovascular (Settakis et al., 2003), se ha informado que ATZ reduce el edema cerebral isquémico en ratas (Czernicki et al., 1994), pero aparentemente no hay más información que relacione el diurético con una posible neuroprotección., Además, y particularmente relacionado con nuestros experimentos con alcohol, se ha demostrado que ATZ y varios isómeros de arilsulfonamida inhiben de manera potente el canal de agua AQP4 (Huber et al., 2007); la posible importancia de este efecto se examina más adelante.

la torasemida, un compuesto a base de sulfonilurea que se considera un diurético de asa más potente que la furosemida pero, según los resultados de ORAC, no posee capacidad antioxidante, ha tenido cierto éxito como agente neuroprotector en modelos de accidente cerebrovascular / edema (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., También inhibe selectivamente la hinchazón glial relacionada con el transporte de Cl, atenuando los aumentos de volumen celular dependientes de la acidosis pero no extracelulares evocados por el glutamato (Staub et al., 1993). En nuestros cultivos de rebanadas HEC, la torasemida bloqueó en gran medida la liberación de LDH evocada por la exposición/abstinencia de alcohol. Aunque la torasemida podría proteger a través de otros mecanismos moleculares como el bloqueo de las vías de los receptores de angiotensina/angiotensina (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001), el resultado es consistente con la visión de que la sobrehidratación del tejido cerebral y sus efectos posteriores son factores potencialmente importantes en el mecanismo neurotóxico del alcohol.

el fracaso de L-644, 711 para proteger contra la neurotoxicidad inducida por atracones de alcohol en los cultivos de corte HEC (Fig. 6) e in vivo (Hamelink et al., 2005) indica que el compuesto, que inhibe principalmente el intercambio de Cl−/HCO3, puede no contrarrestar eficazmente los aumentos de agua cerebral inducidos por el alcohol., Aunque carece de muestra suficiente para estudios in vivo de alcohol/edema, observamos que en un modelo de accidente cerebrovascular en ratas, L-644, 711 fue ineficaz para reducir el edema cerebral (Cole et al., 1991). Con respecto a BUM, en armonía con los Resultados in vivo de Hamelink et al. (2005), este diurético no protegió contra el neurodaño del alcohol de borrachera en el modelo de cultivo de corte HEC. Además, demostramos que, a diferencia de ATZ y furosemida, el edema de corte de HEC inducido por el alcohol de borrachera no fue prevenido por este diurético, posiblemente explicando su falta de neuroprotección., Algunas consideraciones que podrían subyacer a esto son que BUM es considerablemente menos potente que la furosemida en términos de inhibición del transportador kcc2 de extrusión de Cl, pero es un inhibidor 500 veces más fuerte del co− transportador electroneutral Na+- K+-2cl-(Nkcc1) (Payne et al., 2003). Esta diferencia en potencias se cree que subyace a la ausencia de efectos antiepilépticos reportados por BUM en comparación con la inhibición de furosemida de la actividad epileptiforme inducida por K+en cortes de hipocampo (Margineanu y Klitgaard, 2006)., Por lo tanto, es posible que esta divergencia entre BUM y furosemida también sea importante en el contexto de la inhibición/prevención del edema cerebral inducido por el alcohol y la neurodegeneración.

revisitando el tema de la furosemida y su efectividad, el efecto neuroprotector del diurético contra el daño inducido por el alcohol de borrachera podría surgir de una combinación de acciones no disponibles para BUM o L–644, 711. Su prevención del edema cerebral inducido por el alcohol (Collins et al.,, 1998) podría derivarse por primera vez de la potente inhibición del diurético del co-transportador de kcc2 específico del cerebro como se mencionó, con la restauración resultante de la fuerza iónica celular y el volumen. De interés es que los eventos apoptóticos inducidos por el etopósido en fibroblastos – la translocación de la proteína BAX citosólica a las mitocondrias y la consiguiente liberación del citocromo C mitocondrial-fueron suprimidos por la furosemida (Karpinich et al., 2002)., La explicación fue que la translocación de BAX es el resultado de una alteración conformacional en BAX resultante de cambios iónicos y de pH en el medio citosólico, cambios que la furosemida podría contrarrestar a través de la inhibición de la extrusión de Cl. Entre paréntesis, es incierto si los eventos apoptóticos clásicos como la liberación de citocromo C contribuyen significativamente a la neurodegeneración inducida por el alcohol, ya que un estudio en ratas borrachas intoxicadas con alcohol usando un indicador terminal de apoptosis, la tinción de TUNEL, fue en gran medida negativo (Obernier et al., 2002)., Sin embargo, la translocación de BAX y la liberación de citocromo c deben examinarse en los modelos de alcohol de borrachera, ya que estos eventos pueden surgir independientemente de los mecanismos clásicos de apoptosis.

no cuestionamos, sin embargo, que el modo adicional de acción de la furosemida que podría contribuir a la neuroprotección (y posiblemente a la reducción del edema cerebral) podría ser antioxidante., El estrés oxidativo ha sido postulado por nosotros y varios otros como fundamental para el mecanismo neurotóxico del alcohol; de hecho, como se muestra en la tabla 1, La administración de antioxidantes seleccionados (especialmente cannabidiol, vitamina E E hidroxitolueno butilado) proporcionó una neuroprotección significativa en ratas borrachas intoxicadas con alcohol (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), pero las fuentes de especies reactivas de oxígeno (ROS) se entienden imprecisamente. Otras acciones potenciales de la furosemida parecen ser menos relevantes para los modelos de alcohol., Se informa que el diurético es un antagonista del receptor GABA-A en concentraciones similares a las utilizadas en cultivos de rebanadas de HEC, pero el antagonismo se manifiesta principalmente en el cerebelo y no en el hipocampo y la corteza (Korpi y Luddens, 1997).

un punto clave asociado es que nuestro hallazgo preliminar de aumento de AQP4 durante el edema y la neurodegeneración inducidos por el alcohol en atracones de HEC podría ser de importancia emergente en términos del mecanismo basado en el edema del alcohol. La familia de canales de agua acuaporina consiste en varios productos genéticos, siendo AQP4 la forma primaria en el cerebro(Gunnarson et al.,, 2004). Aunque se expresa principalmente en astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), también se expresa por microglía activada por estímulos inflamatorios (Tomas-Camardiel et al., 2004). La evidencia creciente indica que la actividad AQP4 juega un papel instigador en el edema glial celular (citotóxico) en modelos animales de trauma, accidente cerebrovascular e isquemia (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Aunque la naturaleza precisa (i. e.,, citotóxico versus vasogénico) del edema alcohólico compulsivo todavía es incierto, sospechamos que el edema glial es un componente importante, y AQP4 podría tener un papel neuropatológico temprano. Sin embargo, todavía es posible que la elevación de AQP4 sea una respuesta de supervivencia celular al edema y Respuestas neuroinflamatorias asociadas en lugar de (O además de) un paso causativo. Por ejemplo, la regulación ascendente de varios genes de muerte/supervivencia celular, incluido AQP4, se asoció con neuroprotección isquémica debido al preacondicionamiento cerebral inflamatorio (endotoxina) (Mallard y Hagberg, 2007)., Se necesitan estudios con modelos knockdown o knockout para responder a esta pregunta.

nuestro punto de vista actual es que, por cualquier proceso molecular que se inicie, el edema cerebral (en parte citotóxico) y la deformación por estrés celular asociada debido a la exposición repetitiva alta al alcohol y la abstinencia promueven procesos proinflamatorios que abarcan la activación de PLA2 y la movilización excesiva de AA, con un aumento del estrés oxidativo como resultado aguas abajo (Lehtonen y Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). El trabajo de Crews et al. (2004) sugiere que el aumento de citocinas proinflamatorias (p. ej.,, TNFa), también puede estar involucrado. Mientras que las elevaciones intracelulares de ROS debido al estrés por abstinencia de alcohol/alcohol y el edema celular pueden resultar de una serie de rutas además de PLA2 (por ejemplo, citocromos P450, xantina oxidasa, ribonucleótido reductasa, NADPH oxidasa y fuga mitocondrial), AA es a veces el principal contribuyente en un proceso neurodegenerativo de ROS (Bobba et al., 2008). El AA podría producir estrés oxidativo enzimáticamente y no enzimáticamente (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004), así como indirectamente a través de la inducción de NADPH oxidasa (Dana et al.,, 1998); también podría agravar el edema (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Además, las ROS podrían ser señales de retroalimentación positiva, activando aún más las isoformas PLA2 (Martínez y Moreno, 2001). Posiblemente distinto de la generación de ROS, El AA podría alimentar los procesos de muerte de las células al estimular la transición de permeabilidad mitocondrial (Scorrano et al., 2001). Glutamato, liberado por hinchazón astrocítica, así como por AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg y Mongin, 1998), puede exacerbar el estrés oxidativo a través de una vía no excitotóxica que implica la inhibición de la biosíntesis de glutatión (oxidative glutamate toxicity (Tan et al., 2001). Cabe destacar que nuestros actuales estudios de inhibidores con cultivos de cortes HEC indican que el bloqueo de la actividad de PLA2 es neuroprotector contra el tratamiento de atracones de alcohol (Brown et al., 2008)., Sin embargo, una posibilidad mecanicista adicional es el papel integrador potencial en el neurodamago dependiente del alcohol para el factor nuclear kappa B (NF-kB), un factor de transcripción neuroinflamatorio asociado que se informa que está regulado por ácidos grasos poliinsaturados como AA (Maziere et al., 1999), así como por el alcohol en cultivos e intoxicación alcohólica de borrachera in vivo (Zima y Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou y Crews, 2006).,

En resumen, dado que dos diuréticos que carecen de potencia antioxidante, ATZ y torasemida, previenen tanto el edema cerebral como la neurodegeneración inducida por el alcohol, argumentamos que el edema cerebral es probable que sea un factor crítico que conduzca a la neurodegeneración, con su supresión por estos diuréticos, así como por la furosemida (pero no por BUM o posiblemente L–644, 711) proporcionando una neuroprotección significativa. Sin embargo, podrían existir mecanismos de protección adicionales para cada uno de los agentes eficaces., Además, los canales de agua AQP4, evidentemente aumentados por atracones de alcohol, podrían ser importantes en la generación o mantenimiento del edema observado. Se necesitan más estudios para comprender los mecanismos por los cuales la intoxicación alcohólica repetitiva y la abstinencia promueven el edema cerebral, y cómo y si la AQP4 está involucrada centralmente.