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Discussão

Nós temos a proposta de que, induzida pelo álcool degeneração de entorrinal córtex neurônios piramidais e pectínea do grânulo de células em ratos adultos que ocorre devido à repetitivas crises de exposição e retirada está ligada, em grande medida, para nonsynaptic celular (especialmente gliais) inchaço fenômenos., Esta proposta baseou-se na supressão do edema cerebral e da neurodegeneração in vivo e in vitro com a furosemida diurética, um potente inibidor K+− Cl-Co-transporte (Collins et al., 1998; Corso et al. O presente estudo diz respeito principalmente à ATZ e, em menor medida, à torasemida e ao BUM., Entre os principais resultados aqui são de que AQP4 de canais de água parecem ser como potenciadas pelo neurotóxicos consumo excessivo de álcool, exposição in vitro, e que ATZ, um diurético falta antioxidante potência—ao contrário de furosemida—e também um potente inibidor da AQP4 atividade, suprime o consumo excessivo de álcool–dependentes cérebro edema e neurodegeneration in vitro e in vivo.,para verificar o potencial antioxidante da furosemida e determinar se a ATZ e a torasemida possuíam ou não capacidades semelhantes, utilizámos o ensaio ORAC, uma ferramenta padrão amplamente aceite para medições da actividade antioxidante nas indústrias farmacêutica e alimentar (Huang et al., 2002). Como todas as estimativas de antioxidantes, o ensaio ORAC tem as suas deficiências, mas a utilização de radicais peroxil (ou hidroxil) como pró-oxidantes torna-o diferente dos ensaios que envolvem oxidantes que não são necessariamente pró-oxidantes (Prior et al., 2005). No entanto, como enfatizado em outros lugares (Hamelink et al., Por diversas razões, um único parâmetro in vitro de actividade antioxidante não prevê necessariamente a actividade biológica in vivo.

para avaliações in vitro da neurotoxicidade do binge alcohol, a cultura organotípica de corte de HEC tende a replicar o padrão regional de degeneração cerebral observado in vivo, com algumas diferenças como por vezes evidentes danos CA1 e possivelmente envolvimento NMDAR. Suspeitamos que essas diferenças estão relacionadas com a idade adolescente das fatias de HEC na cultura (∼4 semanas de idade em geral) em relação ao cérebro adulto, mas isso requer um estudo mais aprofundado., No entanto, ao reter grande parte das relações neuron-glia e conectividade neuronal do cérebro em maturação intacta, as culturas de corte cerebral têm vantagens distintas para experimentos de neurotoxicidade sobre culturas hipocampais ou corticais dispersas (geralmente fetais) (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Neurodegeneração induzida pelo álcool em culturas de corte cerebral tem geralmente exigido uma exposição subcrónica a concentrações próximas de ∼100 mM, combinada com retiradas (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., No entanto, tais concentrações não são raras na ingestão de Alcoólicos crónicos (Lindblad e Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Determination of neurodegeneration in the slice cultures used PI, a vital stain that labels dying neurons (Vornov et al., 1991), e LDH release, a general measure of neurotoxicity in brain slice cultures that correlates well with PI labeling (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., No que diz respeito às condições de mídia em nossos experimentos de corte cerebral, reconhecemos que eles são provavelmente hiperosmolares em vários graus durante a exposição ao álcool (consistente com o plasma de Alcoólicos durante a intoxicação (Snyder et al., 1992; Purssell et al.), Mas iso-osmolar durante os intervalos de segurança.voltando–se para a metodologia in vivo Neste relatório, os nossos anteriores estudos de neurodegeneração cerebral induzidos pelo álcool (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) utilizou a abordagem original para induzir convulsões de abstinência de álcool (Majchrowicz, 1975), que foi primeiramente notado para promover a degeneração de neurônios piramidais em regiões límbicas (especialmente entorhinal) corticais e células de grânulos do giro dentado (Switzer et al., 1982). Isso implicou intubações de álcool três a quatro vezes ao dia (9-12 g/kg/dia) por um período de 4 dias para gerar valores Bac médios episodicamente altos (360-450 mg/dl), mas com uma taxa de mortalidade por vezes se aproximando de 40%. Modificámos o modelo para um tratamento menos severo (Collins et al.,, 1998) de uma única intubação diária de álcool (∼5 g/kg) durante 7-10 dias, resultando em valores médios de 2—h BAC de ∼250 mg/dl-ainda considerados intoxicação clinicamente grave (Lowenstein et al., 1990) – e menores (∼20%) taxas de mortalidade; Esta modificação foi usada aqui com ATZ. O facto de Neste estudo os valores diários e agregados de 2 h BAC não diferirem entre ratos tratados com álcool e álcool + ATZ (Fig. 6A) evita a possibilidade de que as concentrações de álcool no cérebro mais baixas possam explicar as acções anti-edémicas e neuroprotectivas do diurético.,

O menos grave única diária subcrónica compulsão gera distribuição regional de degeneração (argyrophilic) neurônios que são indistinguíveis de—, mas menos intensa do que aqueles no original Majchrowicz (1975) procedimento. Não se consegue uma neuroprotecção significativa através da inibição NMDAR em nenhum dos protocolos de intoxicação. O grau de edema cerebral induzido é semelhante em ambos os modelos binge; nesse sentido, o aumento da água cerebral na figura 6B, embora uma percentagem aparentemente baixa (0.6 0,6%), representa quase 2,5% de inchaço cerebral (Elliott e Jasper, 1949)., Em resumo, não há indicação de que o procedimento de intoxicação original de Majchrowicz e a sua modificação diária diferem nos mecanismos celulares responsáveis pelo edema cerebral induzido pelo álcool e pela neurodegeneração.

concomitante com a inibição da neurodamagem, a furosemida suprimiu o edema cerebral em ratos adultos devido a intoxicação/privação repetitiva uma vez por dia-um efeito consistente com o bloqueio diurético de Ca2+—inchaço astroglial independente nas fatias hipocampais epileptogénicas (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), nem foi acompanhado por um aumento do NMDAR cerebral apurado com a ligação MK-801 (Rudolph et al., 1997), argumentam ainda contra um mecanismo excitotóxico proeminente. É ainda possível, como sugerido por estudos de receptores ionotrópicos de glutamato em alcoólicos (Preuss et al., 2006) e analisou por outros (Tsai e Coyle, 1998) que a transmissão glutamatérgica excessiva poderia estar envolvida em apreensões de álcool e perturbações na activação Autónoma., No entanto, em ratos adultos intoxicados com álcool, a densidade de neurodegeneração atinge um máximo consideravelmente mais cedo do que o tempo de maior actividade de crises (Majchrowicz, 1975) e não aumenta durante um intervalo de segurança de 36–h., 1996) – sugerindo que a propensão e a neurodamagem das crises não estão directamente relacionadas.

a Tabela 1 resume os efeitos dos três diuréticos sobre os efeitos do álcool excessivo in vitro e/ou in vivo, e contrasta estes resultados com os seus potenciais antioxidantes., Estão incluídos os resultados da cultura HEC slice, bem como os estudos in vivo relatados com BUM e L-644, 711. Inclui também os resultados comunicados com vários antioxidantes já referidos, que serão discutidos a seguir. Os testes da ORAC verificaram que a furosemida é um antioxidante eficaz, sendo pelo menos equipotente com a vitamina E–relacionado Trolox. Com base na actividade da furosemida, bem como resultados positivos com vários antioxidantes estabelecidos e resultados negativos com L-644, 711 e BUM, Hamelink et al., (2005) suggested that furosemide’s protection could be more closely associated with its antioxidant properties than with edema reduction. No entanto, enfatizamos que não foram feitas avaliações de edema cerebral confirmatório no estudo acima mencionado. Por exemplo, se um edema cerebral induzido pelo álcool não tivesse sido afetado in vivo por L–644, 711 ou BUM por barreira hemato-encefálica, metabólica ou outras razões, o Hamelink et al. (2005) em nossa opinião, as conclusões exigiriam uma revisão. E até esse ponto, BUM não conseguiu evitar edema em fatias de carne binge-exposta ao álcool (Fig. 5C)., Além disso, se um mecanismo diferente de edema de dissuasão (como os radicais livres, trapping) foi o principal neuroprotetor um empregado por furosemida, diurético teria sido o esperado para reduzir significativamente o consumo excessivo de álcool–induzida neurodamage em todas as regiões afetadas, mas não conseguiu fazê-lo no bulbo olfativo glomeruli (Collins et al., 1998), uma região não examinada por Hamelink et al. (2005).,

A Tabela 1 também resume que, apesar da falta de capacidade antioxidante, o diurético ATZ, o foco principal destes experimentos atuais, preveniu a acumulação de água nos tecidos induzidos pelo álcool e a neurodegeneração tanto em culturas de corte de HEC como in vivo. Um inibidor da anidrase carbónica e estímulo dilatador cerebrovascular (Settakis et al., 2003), ATZ tem sido relatado para reduzir edema cerebral isquêmico em ratos (Czernicki et al., 1994), mas aparentemente não há mais informações ligando o diurético a possível neuroprotecção., Além disso, e particularmente Germano para as nossas experiências com álcool, a ATZ e vários isómeros de arilsulfonamida demonstraram inibir potentemente o canal de água AQP4 (Huber et al., 2007); a possível importância deste efeito é discutida mais adiante.

torasemida, um composto à base de sulfonilureia que é considerado um diurético de laço mais potente do que a furosemida, mas, de acordo com os resultados do ORAC, não possui capacidade antioxidante, teve algum sucesso como um agente neuroprotector em modelos de acidente vascular cerebral/edema (Prangger, 1992; Staub et al., 1994)., Inibe também selectivamente a tumefacção glial relacionada com a Cl− transporte, atenuando os aumentos do volume de células evocadas, dependentes da acidose, mas não extracelulares, do glutamato (Staub et al., 1993). Nas nossas culturas de corte HEC, a torasemida bloqueou em grande parte a libertação de LDH provocada pela exposição/retirada do álcool excessivo. Embora a torasemida possa proteger através de outros mecanismos moleculares, tais como o bloqueio das vias do receptor da angiotensina/angiotensina (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001), o resultado é consistente com a visão de que o excesso de hidratação do tecido cerebral e seus efeitos a jusante são fatores potencialmente importantes no mecanismo neurotóxico do álcool.

a incapacidade de l-644, 711 para proteger contra a neurotoxicidade induzida pelo álcool nas culturas de corte de HEC(Fig. 6) e in vivo (Hamelink et al., 2005) indica que o composto, que inibe principalmente a troca Cl−/HCO3, pode não combater eficazmente o aumento da água cerebral induzida pelo álcool., Embora faltando amostra suficiente para estudos in vivo de álcool/edema, observamos que em um modelo de acidente vascular cerebral em ratos, L-644, 711 foi ineficaz na redução do edema cerebral (Cole et al., 1991). Em relação ao BUM, em harmonia com os resultados in vivo de Hamelink et al. (2005), este diurético não protegeu contra a neurodamagem do binge alcool no modelo de cultura HEC slice. Nós também mostramos que, ao contrário de ATZ e furosemida, o edema da fatia de HEC induzido pelo álcool binge não foi prevenido por este diurético, possivelmente explicando a sua falta de neuroprotecção., Algumas considerações que podem subjazer que VAGABUNDO é consideravelmente menos potente do que a furosemida em termos de inibição do Cl− -extrusão de KCC2 transportador, mas é uma 500 vezes mais forte inibidor da electroneutral de Na+-K+-2Cl− (NKCC1) co-transportador (Payne et al., 2003). Pensa-se que esta diferença nas potências explica a ausência de efeitos antiepilépticos por parte de bum em comparação com a inibição da actividade epileptiforme induzida pela furosemida em fatias hipocampais (Margineanu e Klitgaard, 2006) por parte da furosemida., Por conseguinte, é possível que esta divergência entre o BUM e a furosemida seja também importante no contexto da inibição/prevenção do edema cerebral induzido pelo álcool e da neurodegeneração.Revisitando a questão da furosemida e sua eficácia, o efeito neuroprotectivo do diurético contra danos causados pelo álcool binge, assim, pode surgir de uma combinação de ações não disponíveis para BUM ou L–644, 711. Sua prevenção de edema cerebral induzido pelo álcool (Collins et al.,, 1998) poderia primeiro derivar da inibição potente do diurético do co-transportador kcc2 específico do cérebro, como mencionado, com a restauração resultante da força e volume iônicos celulares. É interessante notar que os acontecimentos apoptóticos induzidos pelo etoposido em fibroblastos—a translocação da proteína BAX citosólica para as mitocôndrias e a consequente libertação do citocromo C mitocondrial—foram suprimidos pela furosemida (Karpinich et al., 2002)., A explicação foi que a translocação BAX é o resultado de uma alteração conformacional no BAX resultante de alterações iónicas e pH no meio citosólico, alterações que a furosemida pode contrariar através da inibição da Cl− extrusão. Parenteticamente, o facto de os acontecimentos apoptóticos classicamente tais como a libertação do citocromo c contribuírem significativamente para a neurodegeneração induzida pelo álcool é incerto, uma vez que um estudo realizado em ratos intoxicados com álcool a granel utilizando um indicador terminal de apoptose, coloração de TUNEL, foi em grande parte negativo (Obernier et al., 2002)., No entanto, a translocação BAX e a libertação do citocromo c devem ser examinadas nos modelos alcoólicos compulsivos, uma vez que estes acontecimentos podem surgir independentemente dos mecanismos clássicos de apoptose.

não questionamos, no entanto, que o modo adicional de ação da furosemida que pode contribuir para a neuroprotecção (e possivelmente a redução do edema cerebral) pode muito bem ser antioxidante., O stress oxidativo tem sido postulado por nós e por vários outros como fundamental para o mecanismo neurotóxico do álcool; de facto, como demonstrado na Tabela 1, a administração de antioxidantes seleccionados (nomeadamente canabidiol, vitamina E e hidroxitolueno butilado) proporcionou uma neuroprotecção significativa em ratos intoxicados com álcool binge (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), mas as fontes de espécies reativas de oxigênio (ROS) são imprecisamente compreendidas. Outras acções potenciais da furosemida parecem ser menos relevantes para os modelos alcoólicos., O diurético é relatado para ser uma GABA-UM antagonista do receptor em concentrações semelhantes às utilizadas na HEC fatia culturas, mas o antagonismo se manifesta principalmente no cerebelo e não no hipocampo e córtex (Korpi e Luddens, 1997).

um ponto associado chave é que a nossa descoberta preliminar de aumento da AQP4 durante edema e neurodegeneração induzidos pelo álcool excessivo em fatias de HEC pode ter um significado emergente em termos do mecanismo baseado no edema do álcool. A família aquaporin water channel consiste de vários produtos genéticos, com AQP4 a forma primária no cérebro (Gunnarson et al.,, 2004). Embora expresso principalmente em astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), também é expressa por microglia ativada por estímulos inflamatórios (Tomas-Camardiel et al., 2004). Evidências crescentes indicam que a atividade AQP4 desempenha um papel instigador no edema glial celular (citotóxico) em modelos animais de trauma, acidente vascular cerebral e isquemia (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Embora a natureza precisa (i.e.,, citotóxico versus vasogénico) do edema dependente do álcool binge ainda é incerto, suspeitamos que o edema glial é um componente importante, e AQP4 pode, portanto, ter um papel neuropatológico precoce. No entanto, ainda é possível que a elevação de AQP4 seja uma resposta de sobrevivência celular ao edema e Respostas neuroinflamatórias associadas ao invés de (ou além de) um passo causativo. Por exemplo, a regulação de uma série de genes de morte/sobrevivência celular, incluindo AQP4, foi associada à neuroprotecção isquêmica devido ao pré-condicionamento cerebral inflamatório (endotoxina) (Mallard e Hagberg, 2007)., Estudos com modelos de knockdown ou knockout são necessários para responder a esta pergunta.o nosso ponto de vista actual é que, seja qual for o processo molecular iniciado, o edema cerebral (em parte citotóxico) e a deformação do stress celular associada devido à exposição repetida ao álcool e à retirada promovem processos pró-inflamatórios que englobam a activação do PLA2 e a mobilização excessiva do AA, com o aumento do stress oxidativo como resultado a jusante (Lehtonen e Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). The work of Crews et al. (2004) sugere que o aumento das citoquinas pró-inflamatórias (ex.,, TNFa), pode também estar envolvido. Embora as elevações intracelulares de ROS devido ao estresse de abstinência do álcool/álcool e edema celular possam resultar de uma série de rotas além de PLA2 (por exemplo, citocromos P450, xantina oxidase, ribonucleótido redutase, NADPH oxidase e fuga mitocondrial), AA é às vezes o principal contribuinte em um processo neurodegenerativo ROS (Bobba et al., 2008). AA poderia produzir estresse oxidativo enzimático e não-enzimático (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004), bem como indiretamente via indução da NADPH oxidase (Dana et al.,, 1998); pode também agravar o edema (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Além disso, a ROS pode ser um sinal positivo de feedback, activando ainda mais as isoformas do PLA2 (Martinez e Moreno, 2001). Possivelmente distinta da geração ROS, AA poderia alimentar processos de morte celular estimulando transição de permeabilidade mitocondrial (Scorrano et al., 2001). Glutamato, libertado por inchaço astrocítico, bem como por AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg e Mongin, 1998), podem exacerbar o stress oxidativo através de uma via não excitotóxica que envolve a inibição da biossíntese da glutationa (toxicidade oxidativa do glutamato (Tan et al., 2001). Note-se que os nossos actuais estudos de inibidores com culturas de corte HEC indicam que o bloqueio da actividade do PLA2 é neuroprotector contra o tratamento do álcool de passagem (Brown et al., 2008)., No entanto, uma outra possibilidade mecanicista é o potencial papel integrativo na neurodamagem dependente do álcool para o fator nuclear kappa B( NF-kB), um fator de transcrição associado às neuroinflamações que é relatado para ser atualizado por ácidos graxos poliinsaturados como AA (Maziere et al., 1999), bem como pelo álcool em culturas e intoxicação alcoólica in vivo (Zima e Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou and Crews, 2006).,

Em resumo, uma vez que dois diuréticos que falta antioxidante potência, ATZ e torasemide, evitar tanto o edema cerebral e consumo excessivo de álcool–induzida neurodegeneration, argumentamos que o cérebro edema tende a ser um fator crítico, levando a neurodegeneration, com sua supressão por esses diuréticos, bem como a furosemida (mas não de VAGABUNDO ou, possivelmente, L-644, 711), proporcionando significativo neuroproteção. No entanto, poderão existir mecanismos de protecção adicionais para cada um dos agentes eficazes., Além disso, os canais de água AQP4, evidentemente aumentados pelo álcool binge, podem ser importantes na geração ou manutenção do edema observado. São necessários mais estudos para compreender os mecanismos através dos quais a intoxicação alcoólica repetitiva e a abstinência promovem o edema cerebral, e como/se AQP4 está envolvida centralmente.