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hipertricose generalizada congênita (CGH) é um grupo geneticamente e fenotipicamente heterogêneo de condições raras caracterizadas pelo crescimento universal do cabelo. É a principal característica fenotípica de muitas síndromes genéticas distintas e pode ser herdada como uma característica dominante autossômica ou ligada a X.,1-5 o fenótipo CGH gerou muito interesse científico e atenção da mídia, em grande parte por causa do fenótipo Peludo impressionante e sua natureza aparentemente atavística.6,7 até o momento, defeitos genéticos foram encontrados em duas formas de CGH autossômico-dominante. Autossômica dominante congênita generalizada hipertricose terminalis, com ou sem hiperplasia gengival (MIM 135400) está associada com cópia-número de variações (CNVs), ou microdeletions ou microduplication, no cromossomo 17q24 em familiar e casos esporádicos.,5 rearranjos do cromossomo 8 e um possível efeito de posição foram detectados na hypertrichosis universalis congenita, Tipo Ambras (MIM 145701).8 Figuera et al. mapeou o primeiro CGH locus para o cromossomo Xq24-q27. 1 em 1995 em uma grande família mexicana segregando hipertricose X-ligada (MIM 307150).Posteriormente, o mapeamento genético foi confirmado em um kindred mexicano com uma síndrome de hipertricose congênita associada a X consistindo de CGH, surdez e anomalias dentárias.4 No entanto, a mutação subjacente permanece não identificada.,

doenças genômicas são uma classe crescente de doenças humanas que são causadas por um rearranjo genômico que pode levar à perda completa ou ganho de um gene(s) sensível a um efeito de dosagem ou, alternativamente, pode perturbar a integridade estrutural de um gene.9 Microdeletions e microduplicações são mais frequentemente associadas a distúrbios genômicos humanos.,9-11 outro tipo de rearranjo genômico, visto com menor frequência, é uma inserção permiromossômica onde há uma intercalação de uma parte de um cromossomo em outro, cromossomo não-homólogo e também é referido como uma translocação inter -romossômica.12 a recente aplicação de sequenciação massivamente paralela (MPS) e análise do genoma do CNV em alta resolução rapidamente desvendou a base genética de muitas raras desordens mendelianas e genômicas.,10-14 Aqui, vamos adicionar X-linked hipertricose congênita síndrome, entre o mais raro dos raros condições, para a lista de doenças de relatório sobre a identificação de independentes interchromosomal inserções envolvendo diferentes autossômica segmentos mediada pelo mesmo pequeno palíndromo em Xq27.1 em cada um dos dois X-linked CGH famílias de diferentes origens étnicas.a primeira vez que constatamos uma família chinesa de cinco gerações com uma síndrome distinta de CGH, escoliose e espinha bífida (figuras 1A e 1B). A família tinha 11 indivíduos afetados (figura 1A)., Todos os quatro machos afetados disponíveis para avaliação fenotípica tinham hipertricose grave associada à escoliose, enquanto todas as fêmeas afetadas tinham apenas hipertricose leve, o que era consistente com a herança associada a X (figuras 1B-1D). A sonda, um homem de 41 anos, também tinha espinha bífida apresentando-se como meningoceles cervicais e sacrais (figura 1C). Os outros dez indivíduos afetados não exibiram espinha bífida., Recolhemos amostras de sangue de 19 membros da família participantes (oito afetados, sete Não afetados e quatro cônjuges) após obter consentimento informado dos participantes e aprovação do Conselho de revisão institucional da Faculdade de Medicina de Pequim. A amostragem coriónica villus foi realizada para o participante V1 (figura 1A). O ADN genómico foi extraído através de métodos padrão., Para determinar se o X-linked hipertricose congênita síndrome mapeada para o mesmo locus, como relatado anteriormente, no méxico CGH família,3 foram determinados genótipos em 17 membros da família, às 14 polimórficos microsatellite marcador de loci de Xq26.3-p27.2 região (Tabela S1 disponível on-line), das quais 11 foram desenvolvidos com o uso da UCSC Genoma Humano Navegador. A análise de ligação de dois pontos e o cálculo da pontuação LOD foram realizados com o programa MLINK do software de pacote LINKAGE (versão 5.2)., Os parâmetros utilizados na análise de ligação foram herança dominante associada a X, penetração completa, uma taxa de mutação de frequência zero, igual de microssatelite-alelo, e uma frequência de doença-alelo de 1 em 10 000. Nossa análise de ligação de dois pontos produziu uma pontuação máxima de LOD de 3,91 a θ = 0 para cinco marcadores (tabela S2), confirmando a ligação genética ao mesmo locus na família chinesa. Com base nos haplótipos, observamos dois eventos de recombinação, um em III5 e o outro em IV2 (figura S1)., Outras análises de haplótipo nestes dois recombinantes definiram a região crítica a um intervalo entre ZLS3 e ZLS10, representando um intervalo genómico de 5,6 Mb contendo 40 genes de RefSeq (figura 1E e figura S1). Realizamos a amplificação e sequenciação de PCR de todos os exons e suas sequências intrônicas flanqueadas para esses genes no proband (figura 1E; informação de primer está disponível mediante pedido), mas não identificamos nenhuma mutação patogênica.,

Fenótipos e Locus Genético dos Distintos X-Linked Hipertricose Congênita Síndrome

(A) o Pedigree dos cinco-geração de Chineses família com onze indivíduos afetados. Para V1, o diagnóstico foi feito a partir de uma amostra de villus coriônico. Indivíduos cujo DNA estava disponível são indicados por”+.”

(B) fotografia da sonda que mostra CGH grave.C) Fotografia e imagem de ressonância magnética que mostram um meningocele cervical na sonda.

(D) imagem de Raio-X da sonda que mostra escoliose.

(E) diagrama esquemático de Xq26.,3-q27.2 mostrando os genes RefSeq na região crítica para a síndrome de hipertricose congênita associada a X. Uma barra azul sólida representa a região crítica. As posições de todos os marcadores genéticos utilizados na análise das ligações são mostradas.

para determinar se a síndrome de hipertricose congênita associada a X foi causada por uma microdeleção ou microduplicação desconhecida, realizamos uma varredura CNV de alta resolução em todo o genoma em quatro indivíduos afetados (dois machos e duas fêmeas), usando a matriz SNP humana de Affymetrix 6.,0 contendo mais de 906.600 SNPs e mais de 946.000 sondas com números de cópia. Amostras de ADN genómico de quatro indivíduos afetados (dois machos, II9 e III5; e duas fêmeas, III3 e IV2) foram genotipada no CapitalBio Corporation (Pequim, China) com o SNP Array 6.0 de acordo com o fabricante protocolos. Genotipagem chamada, Controle de qualidade genotipagem, e identificação CNV foram realizados com o software Affymetrix Genotiping Console 3.0. As chamadas de Estado de Copy-number foram determinadas com o algoritmo Canário embutido no Pacote Affymetrix Genotyping Console 3.0., Nós não detectar o potencial patogênico CNVs crítico da região, mas não encontrou um >121 kb microduplication do COL23A1 locus no 5q35.3 (CN_143030 para CN_1143071) em todos os quatro indivíduos (Figura 2A).

a Identificação de uma característica Interchromosomal de Inserção no Xq27.1 da Família Chinesa com uma Distinta X-Linked Hipertricose Congênita Síndrome

(Uma) Cópia-número do estado de 600 kb do genoma região no cromossomo 5q35.3 mostrando a presença de um microduplication no proband. CN, número de cópia.,B) validação da microduplicação e sua segregação com o fenótipo da doença por qPCR. RCN, número relativo da cópia. As barras de erro representam a SD.

(C E D) sinais de peixes de duas cores num núcleo interfase representativo (C) e cromossomas metafase típicos (D) demonstrando o evento de inserção. BAC sondas são CTD-2507I18 (vermelho), RP11-55E17 (verde), e RP11-671F22 (verde). Ver Figura 4A para as posições dos clones BAC.

(E E F) análise da sequência das junções de inserção proximal (e) e distal (F). Sequências de referência em Xq27.1 e 5q35.,3 estão indicados em vermelho e azul, respectivamente. A junção proximal contém uma microinserção do cromossomo X (preto) e uma microinserção de 2 bp (verde) de origem desconhecida.

(G) PCR amplificação da junção de inserção distal mostrando segregação da inserção com o fenótipo.todas as posições genómicas correspondem à sequência de referência humana de fevereiro de 2009 (GRCh37).

para confirmar a duplicação genómica da região 5q35.3, concebemos os iniciadores para um ensaio de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) utilizando o Primer Express v2.,0 software (Sistemas Biológicos aplicados). Realizamos o qPCR como descrito anteriormente.15 o número relativo de cópias (RCN) das sequências-alvo foi determinado com o método comparativo ΔΔCT. Um ∼1,5 vezes RCN foi usado para duplicação. As experiências do qPCR foram repetidas três vezes. Os iniciadores utilizados nos ensaios qPCR são indicados no quadro S1. O nosso ensaio qPCR confirmou a microduplicação e também mostrou uma segregação total da microduplicação com o fenótipo da doença na família (figura 2B), sugerindo um possível Evento de inserção intercromosómica na região crítica.,

realizamos duas cores de interfase e fluorescência da metafase na hibridização in situ (FISH) para confirmar a inserção na família chinesa. O bacterial artificial chromosome (BAC) clones CTD-2507I18, RP11-55E17, e RP11-671F22 foram selecionados para cobrir o duplicado região de COL23A1 MIM (610043) em 5q35.3, FHL1 MIM (300163) em Xq26.3, e F8 (MIM 300841) no cromossomo Xq28, respectivamente (Figura 4A). As amostras de DNA BAC do RP11-55E17 e RP11-671F22 foram rotuladas individualmente com Espectrumgreen-dUTP (Abbott Molecular), e o DNA CTD-2507I18 foi rotulado com Cy3-dUTP (GE Healthcare Life Sciences)., Os núcleos de interfase e os cromossomos de metafase foram co-modificados com um par de sondas de referência Espetrumgreen-dUTP (sinal verde) e sonda de teste Cy3-dUTP (sinal vermelho), contrastados com DAPI, e visualizados por microscopia de fluorescência., A cor do sinal de PEIXE padrões observados em ambos os núcleos de interfase (Figura 2C) e metafase cromossomos (Figura 2D e Figura S2) foram consistentes com um interchromosomal evento de inserção, como indicado pela presença de sinais vermelhos para COL23A1 no cromossomo 5 homologs e no cromossomo X, entre o verde sinais correspondentes a FHL1 no X26.3 e F8 no cromossomo Xq28 (Figura 2D e Figura S2).,

Interchromosomal Inserções Mediada pela Mesma Humanos Específicos Palíndromo

(A) diagrama Esquemático representando as duas independente inserções encontrados no presente estudo. As barras sólidas vermelhas representam os fragmentos inseridos e os tamanhos indicados correspondem aos pares de base (bp). As linhas vermelhas mostram a orientação das inserções. As posições das sondas BAC utilizadas em peixes de duas cores e dos genes RefSeq nas regiões cromossómicas correspondentes são mostradas.,

(B) Diagrama Esquemático do palíndromo específico para o homem de 180 bp, com um resumo dos pontos de paragem identificados no presente estudo. Triângulos sólidos indicam pontos de ruptura de inserção nas duas famílias de estudo (chinês em vermelho e mexicano em verde). JBPcn, ponto de paragem de junção na família chinesa; JBPmx, ponto de paragem de junção na família mexicana. Triângulos abertos representam os pontos de ruptura de deleção em indivíduos normais (Chinês em vermelho, mexicano em verde, e Yoruban em preto). Uma barra sólida preta representa o elemento linha – 1 que contém a jbpcn proximal., É dada a posição precisa da JBPcn.

(C) diagrama esquemático que mostra o pequeno palíndromo específico do ser humano no Xq27.1 e as suas sequências de flanco. A sequência palindromática de 180 bp está encaixotada. Um chimpanzé tem duas metades do palíndromo, mas em orientação direta. Todos os outros três primatas não humanos só têm metade do palíndromo.todas as posições genómicas correspondem à sequência de referência humana de fevereiro de 2009 (GRCh37).,

em paralelo com as análises acima descritas do CNV e do peixe, realizámos captura direccionada e MPS no proband utilizando as tecnologias de sequenciação Roche NimbleGen SeqCap e 454. Dois personalizado Sequência de Captura 385K humanos matrizes foram inicialmente concebidos e fabricados em Roche Nimblegem, cada um tendo 385,000 única SeqCap sondas, como determinado pelo SSAHA algoritmo, cobrindo 88.1% de destino região crítica entre ZLS3 e ZLS10 (chrX: 135,204,482–140,853,096; GRCh37, hg19) (Figura 1E)., O DNA capturado foi sequenciado em um sistema FLX sequenciador de genoma com a química da série de titânio GS FLX na Roche 454 Life Sciences. A sequência resultante foi mapeada para a referência humana hg18 com o software mapeador de referência GS e totalizou 555 Mb de dados de sequência com cerca de 98% mapeados de volta para a região alvo. Outras análises com o software mapeador de referência 454 GS revelaram as sequências de inserção distal (figura S3), apontando o ponto de ruptura dentro do cromossomo X (chrX: 139,502,951) para o centro de uma sequência palindromica curta de 180 bp em Xq27.,1, que está localizado 82 kb a jusante de SOX3 (MIM 313430) (figura S2, figuras 4A e 4B). Usamos PCR de longo alcance para amplificar as junções de inserção. Os iniciadores foram projetados a partir das sequências que flanqueiam o palíndromo em Xq27.1 e os pontos de ruptura com base na matriz SNP 6.0 coordenadas genômicas., Análise da sequência da resultante amplicons por sequenciação Sanger verificado distal junção encontrado no alvo de seqüenciamento de genoma (Figura 2F), colocado do outro cromossoma X ponto de interrupção formando a inserção proximal cruzamento no meio da LINHA-1 elemento do lado da pequena palíndromo (Figura 2E e Figura 4B), e indicou que o mutante cromossoma X, que tinha uma inserção direta de um 125,577 bp fragmento de dentro COL23A1 (Figuras 2E e 2F, Figura 4A); i.é., der(X)dir ins(X;5)(p27.1;q35.3)., Esta inserção demonstrou ocorrer concomitantemente com uma supressão de 1263 bp entre os dois pontos de paragem do cromossoma X no xq27.1 (figuras 2E e 2F). Consistente com o ensaio qPCR, o nosso ensaio PCR de junção na família revelou fragmentos específicos dos tamanhos esperados em todos os indivíduos afectados, mas em nenhum dos membros da família não afectados (figura 2G).

a descoberta da inserção mediada por uma sequência palindromica curta na família chinesa levou-nos a examinar a família CGH mexicana originalmente relatada com ligação X (figura 3A). Utilização da matriz SNP 6.,0 para o exame dos quatro membros da família (dois afetado e dois inalterados) para CNVs revelou um microduplication de uma >278 kb fragmento sobre 4q31 (SNP_A-2053483 para SNP_A-1883747), abrangendo PRMT10 e TMEM184C e envolvendo partes do ARHGAP10 MIM (609746) e EDNRA MIM (131243), em membros afetados (Figura 3B e Figura 4A). Validámos esta microduplicação através de um ensaio qPCR (figura 3C) e obtivemos informação de ponto de paragem utilizando uma abordagem de junção semelhante PCR (figuras 3D e 3E)., Nossos resultados sugerem que os membros afetados na família Mexicana tinha herdado um mutante cromossoma X com invertido inserção de um 300,036 bp fragmento do 4q31.22-p31.23 região (Figuras 3D e 3E, Figura 4A); i.é., der(X)inv ins(X;4)(q27.1;p31.23q31.22). O exame de todos os membros da família disponíveis para inserção com a utilização de um teste PCR de junção confirmou a segregação do evento insercional com o fenótipo CGH (figura 3F)., Muito curiosamente, ambos os dois ” X pontos de interrupção identificados na família Mexicana eram o centro do palíndromo (chrX: 139,502,951 e 139,502,958) (Figuras 3D e 3E, Figura 4B), o que reforça o papel da pequena palíndromo como um mediador na iniciação das duas inserções identificados neste estudo.

identificação de uma inserção profissional hereditária no Xq27.1 na família mexicana com CGH X-Linked

(a) genealogia da família mexicana de cinco gerações com CGH X-linked., Indivíduos cujo DNA estava disponível são indicados por”+.”

(B) Copy-number state of a 600 kb genomic region on chromosome 4q31 showing the presence of a microduplication in an affected individual. CN, número de cópia.C) validação da microduplicação por qPCR. RCN, número relativo da cópia. As barras de erro representam a SD.

(D E e) análise da sequência das junções de inserção proximal (D) e distal (e). As sequências de referência em Xq27. 1 e 4q31 são indicadas em vermelho e azul, respectivamente. A junção distal contém uma microinserção de 25 bp.,

(F) PCR amplificação da junção de inserção proximal mostrando segregação da inserção com o fenótipo.todas as posições genómicas correspondem à sequência de referência humana de fevereiro de 2009 (GRCh37).

identificámos inserções independentes mediadas pelo mesmo pequeno palíndromo em Xq27.1 em duas famílias diferentes afectadas pela hipertricose associada a X. Além disso, a segregação completa destas inserções com os fenótipos forneceu provas adicionais de apoio para o seu papel causal., Para determinar se essas inserções foram exclusivo para essas famílias e para excluir a possibilidade de sua representando normal genómico de variação na população, exibimos 740 controle masculino indivíduos (215 Chinês, 118, Mexicanos e 407 Asiático, Indiano) por PCR, usando primers derivados de sequências de acompanhamento, o palíndromo (Tabela S1), e que não detectáveis de inserção., Além disso, os CNV que envolvem os dois segmentos inseridos identificados não são reportados na Base de dados pública de variantes genómicas e não estão presentes em 1274 indivíduos de controlo chineses (1074 de Xangai e 200 de Hong Kong). Em conjunto, os nossos resultados sugerem que as inserções mediadas pelo palíndromo são a causa subjacente para CGH isolada e sindromica associada ao X.as sequências Palindrómicas não são estáveis e podem induzir rearranjos genómicos, incluindo delecções e translocações recorrentes.16-18 a sequência palindromática de 180 bp está presente apenas em seres humanos., É flanqueada por uma repetição da linha-1 e uma sequência LTR (figura 4C). O exame da região ortóloga no genoma do chimpanzé revela as duas metades do palíndromo, mas eles estão em orientação direta e são separados pela sequência LTR. Outros primatas não humanos, incluindo o orangotango, rhesus e marmoset, têm apenas metade do palíndromo (figura 4C). Estes resultados sugerem que o palíndromo é evolutivamente muito jovem., A análise PCR acima mencionada em indivíduos de controle, no entanto, detectou deleções que variam em tamanho de 173 bp a 9104 bp em nove indivíduos (dois chineses, dois mexicanos e cinco indianos Asiáticos) (tabela S3). Além disso, uma eliminação de 209 bp foi evidente em um indivíduo Yorubano submetido a sequenciação do genoma inteiro.19 notavelmente, todas estas dez supressões tinham um ponto de paragem no centro do palíndromo (tabela S3), apagando assim metade do palíndromo. Assim, parece que a sequência palíndromica específica humana no Xq27.,1 é propenso a quebra e, portanto, representa um ponto quente para rearranjos genômicos, incluindo inserção.

um evento de inserção intertromosómica requer pelo menos três eventos de ruptura e, portanto, não só é mais raro, mas também mais complexo em comparação com os tipos comuns de rearranjo genómico (microdeleção, microduplicação e translocação terminal). Estudos anteriores de inserções intermodais microscopicamente visíveis estimaram a incidência em 1: 80.000 nascimentos vivos.,20 no entanto, recentemente, a análise de hibridação genómica comparativa baseada em matriz de alta resolução (aCGH) e a confirmação de peixes de 18.000 amostras clínicas identificaram 40 inserções intermodais (1:500), indicando assim que podem não ser tão raras como anteriormente se pensava.12 inserções Intermromossomais podem produzir um fenótipo de doença alterando a atividade de um gene. Se um(s) gene (s) dentro da inserção é sensível à dose, a sua expressão pode ser aumentada. O evento de inserção pode perturbar um gene e causar uma perda ou um ganho de função., A expressão aberrante de um gene pode resultar da inserção de uma nova sequência dentro ou perto do gene por causa de um efeito de posição ou da introdução de novas sequências reguladoras. No mutante de rato dançarino espontâneo (Dc), uma inserção permutável no primeiro intrão de Tbx10 de um fragmento genómico contendo o promotor p23 pode causar expressão ectópica Tbx10, produzindo assim fissuras nos lábios e placas em homozigotos.,21 através de uma combinação de um scan CNV baseado em microarray de alta resolução e sequenciamento genômico direcionado, nós fomos capazes de encontrar inserções patogênicas independentes em CGH ligado a X. Os dois eventos de inserção mostraram ser mediados pelo mesmo palíndromo pequeno que está situado em uma região de 485 kb do deserto genético flanqueado telomericamente por SOX3 codificando o Fator de transcrição SRY (região de determinação do sexo Y)-caixa 3 (Figura 4A)., SOX3 é o gene candidato mais intrigante, porque seu fim de 3′ é de 82 kb de telômero para o palíndromo e a família de fatores de transcrição SOX está entre os grupos mais importantes de Reguladores de desenvolvimento. Postulamos que as inserções mediadas pelo palíndromo identificadas em nosso presente estudo podem ter introduzido elementos regulatórios específicos aos tecidos e, portanto, induzido a expressão ectópica de SOX3 em folículos capilares (HFs) ou células precursoras, o que pode causar um padrão aberrante de cabelo e resultar no fenótipo anormal.,as mutações

no SOX3 foram associadas a atraso mental associado ao X com deficiência isolada em hormona do crescimento (MIM 300123),22 e também com hipopituitarismo ligado ao X (MIM 312000).23 Microduplicações que englobam SOX3 foram encontradas no hipopituitarismo ligado a X.23 no hipoparatiroidismo recessivo ligado a X (MIM 307700), foi identificada uma inserção de um fragmento intra-gênico de aproximadamente 340 kb do SNTG2 (MIM 608715) em 2p25.3 em um local Xq27.1 67 kb a jusante do SOX3.24 Este evento de inserção acompanha uma eliminação de 23-25 kb que inclui o palíndromo específico do homem., Um efeito de posição na expressão SOX3 foi sugerido como o mecanismo patogênico subjacente.24 recentemente, Sutton et al. relataram rearranjos genômicos, incluindo microduplicações e uma eliminação na região SOX3, em três pacientes com XX reversão sexual masculina (MIM 300833) com pontos de ruptura na região regulatória SOX3.Embora os pontos de ruptura precisos destes rearranjos não estejam disponíveis em seu estudo, parece que a região genômica envolvida nos eventos de inserção relatados em nosso estudo é duplicada em dois dos três pacientes relatados., Os doentes acima descritos com hipopituitarismo associado a X, hipoparatiroidismo recessivo ligado a X ou reversão sexual masculina não apresentam o fenótipo da hipertricose.23-25 Adicionalmente, as fêmeas com deleções Xq26-q28, que podem resultar em uma perda de SOX3, desenvolvem falha ovária prematura 1 (MIM 311360), mas não hipertricose.,26-29 juntos, estes fornecem suporte para a nossa hipótese de que o CGH ligado X COM ou sem escoliose e spina bifida resulta dos eventos de inserção introduzindo novos elementos reguladores de DNA dentro de cada uma das sequências inseridas, em vez da criação de um “efeito de posição” pela separação física do gene de seus elementos reguladores intrínsecos.

SOX3 está intimamente relacionado com SOX2( MIM 184429), o gene que codifica um regulador chave para as células estaminais, mas até à data, não é conhecido por ser expresso em HFs., Foi demonstrado que as células da papila dérmica que expressam o Sox2 especificam os tipos de HF do rato e induzem a morfogénese HF.30,31 com o uso de RT-PCR (tabela S1), não foi possível detectar a expressão de mRNA SOX3 em HFs isolados do tecido da pele do couro cabeludo doado por indivíduos saudáveis após cirurgia cosmética ou a partir de uma amostra de pele retirada do braço superior do proband da família chinesa (figura S4). Assim, parece razoável especular que as inserções mediadas pelo palíndromo podem ter induzido a expressão ectópica SOX3 em uma fase inicial do desenvolvimento de HF., O fragmento inserido na família chinesa pode conter elementos regulamentares adicionais e, assim, conduzir a malformações adicionais, incluindo escoliose. Coincidentemente, CNVs em 17q24 perto de SOX9 (MIM 608160), o gene que codifica um regulador essencial de células estaminais HF,32, 33 causa CGH autossômica dominante.5 outros estudos são necessários para determinar se a expressão aberrante de SOX3 ou SOX9 altera o padrão do cabelo como implicado por estes estudos.