PMC (Norsk)

Diskusjon

Vi har foreslått at alkohol-indusert degenerasjon av entorhinal kortikale pyramidal nevroner og dentate granule celler i voksne rotter som oppstår på grunn av gjentatte anfall av eksponering og uttak er knyttet til en betydelig grad til å nonsynaptic mobilnettet (spesielt glial) hevelse fenomener., Dette forslaget var basert på undertrykkelse av både hjerne ødem og neurodegeneration in vitro og in vivo ble oppnådd med vanndrivende furosemide, en potent K+-Cl− co-transport-hemmer (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998); den foreliggende studien er bekymret hovedsakelig med ATZ og, til en viss grad, torasemide og ROMPA., Blant de viktigste resultatene her er at AQP4 vann-tv ser ut til å være oppregulert av neurotoxic overstadig alkohol eksponering in vitro, og at ATZ, et vanndrivende mangler antioksidantkraft—i motsetning til furosemide—og også en potent hemmer av AQP4 aktivitet, undertrykker overstadig alkohol–avhengige hjerne ødem og neurodegeneration in vitro og in vivo.,

for Å bekrefte furosemide er antioksidant potensial og til å avgjøre hvorvidt eller ikke ATZ og torasemide besatt lignende evner, vi utnyttet ORAC-analysen, er en allment akseptert standard verktøy for antioksidant aktivitet målinger i farmasøytisk industri og næringsmiddelindustrien (Huang et al., 2002). Som alle antioksidant beregninger, ORAC-analysen har sine mangler, men bruk av peroxyl (eller hydroksyl) radikaler som pro-oksidanter som gjør det forskjellig fra analysene som involverer oksidanter som ikke nødvendigvis pro-oksidanter (Prior et al., 2005). Likevel, som understreket andre steder (Hamelink et al.,, 2005), for en rekke årsaker, én i in vitro-parameteren med antioksidant aktivitet ikke nødvendigvis forutsi biologiske aktivitet in vivo.

For in vitro vurderinger av overstadig alkohol neurotoxicity, den organotypic HEKTIS skive kultur har en tendens til å gjenskape den regionale hjernen degenerasjon mønster observert i vivo, med noen forskjeller som noen ganger tydelig CA1 skade og muligens NMDAR engasjement. Vi mistenker at disse forskjellene er relatert til de unges alder av HEKTIS stykker i kultur (∼4 ukers alder totalt sett) i forhold til voksne hjernen, men dette krever videre studier., Likevel, i å beholde mye av nevron-glia relasjoner og neuronal tilkobling av intakt modning av hjernen, hjernen skive kulturer har klare fordeler for neurotoxicity eksperimenter spredt over (vanligvis fosterets) hippocampal eller kortikale kulturer (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Alkohol-indusert neurodegeneration i hjernen skive kulturer har vanligvis nødvendig subchronic eksponering for konsentrasjoner nærmer ∼100 mM, kombinert med uttak (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Imidlertid, slike konsentrasjoner er ikke uvanlig i binging kroniske alkoholikere (Lindblad og Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Fastsettelse av neurodegeneration i skive kulturer brukt PI, en viktig flekker som etiketter døende nevroner (Vornov et al., 1991), og LDH utgivelsen, et generelt mål på neurotoxicity i hjernen skive kulturer som korrelerer godt med PI merking (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., Med hensyn til media forhold i hjernen vår del eksperimenter, vi erkjenner at de er tilbøyelige til å være hyperosmolar til varierende grader i løpet av alkohol eksponering (i tråd med plasma av alkoholikere under rusen (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), men iso-osmolar under uttak perioder.

Slå til in vivo-metodikk i denne rapporten, vår tidligere overstadig alkohol–indusert hjernen neurodegeneration studier (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) benyttes det opprinnelige tilnærming for å indusere alkoholabstinens beslag (Majchrowicz, 1975), som først ble kjent for å fremme degenerasjon av pyramidal nevroner i limbiske (spesielt entorhinal) kortikale områder og granule celler av dentate gyrus (Switzer et al., 1982). Dette innebar alkohol intubations tre til fire ganger daglig (9-12 g/kg/dag) for en 4-dagers periode for å generere episodically høy gjennomsnittlig BAC verdier (360-450 mg/dl), men med en dødelighet noen ganger nærmer seg 40%. Vi modifiserte modellen til et mindre alvorlige-behandling (Collins et al.,, 1998) for en enkelt daglig alkohol intubasjon (∼5 g/kg) for 7-10 dager, som gir gjennomsnittlig 2-h BAC verdier av ∼250 mg/dl—fortsatt anses som klinisk alvorlig forgiftning (Lowenstein et al., 1990) og lavere (∼20%) dødelighet; denne endringen ble brukt her med ATZ. Det faktum at i denne studien den daglige og den samlede 2-h BAC verdier som ikke skiller mellom alkohol og alkohol + ATZ-behandlet rotter (Fig. 6A) obviates muligheten for at lavere hjernen alcohol konsentrasjoner kan forklare den vanndrivende anti-edemic og neuroprotective handlinger.,

De mindre alvorlige daglig subchronic overstadig genererer regionale fordelingen av dårligere (argyrophilic) nevroner som er umulig å skille fra—men mindre intense enn de i den opprinnelige Majchrowicz (1975) prosedyre. Ingen vesentlige neuroprotection oppnås ved NMDAR hemming i enten rus-protokollen. Graden av indusert hjerne ødem er lik i begge overstadig modeller; i den forbindelse, hjernen vann øke i Figur 6B, selv om en tilsynelatende lav prosentandel (∼0.6%), representerer nesten 2.5% hjerne hevelse (Elliott og Jasper, 1949)., I korte trekk, det er ingen indikasjon på at den opprinnelige Majchrowicz rus prosedyre og sin gang daglig endring forskjellige i cellulære mekanismer som er ansvarlig for alkohol-indusert hjerne ødem og neurodegeneration.

Samtidig med å hemme neurodamage, furosemide undertrykt hjerne ødem i voksne rotter på grunn av repeterende gang daglig rus/uttak—en effekt i samsvar med vanndrivende ‘ s blokade av Ca2+-uavhengig astroglial hevelse i epileptogenic hippocampal skiver (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), og heller ikke var det ledsaget av økt hjernen NMDAR som konstatert med MK-801 bindende (Rudolph et al., 1997), hevder videre mot en fremtredende excitotoxic mekanisme. Det er fortsatt mulig, som foreslått av studier av ionotropic glutamat-reseptorer i alkoholikere (Preuss et al., 2006) og vurdert av andre (Tsai og Coyle, 1998), som overdreven glutamatergic overføring kan være involvert i alkoholabstinens beslag og forstyrret autonom aktivering., Imidlertid, i overstadig alkohol–berusede voksne rotter, tettheten av neurodegeneration når et maksimum betydelig tidligere enn den tiden som er av største anfall aktivitet (Majchrowicz, 1975), og gir ikke økt i løpet av en 36-h tilbakeholdelsestid (Collins et al., 1996)—noe som tyder på at anfall tilbøyelighet og neurodamage er ikke direkte relatert.

Tabell 1 oppsummerer virkninger av de tre diuretika på overstadig alkohol effekter in vitro og/eller in vivo, og kontraster disse funnene med deres antioksidant potensial., Våre HEKTIS skive kultur resultater så vel som rapportert i vivo studier med ROMPA og L-644, 711, er inkludert. Det inkluderer også rapportert resultater med flere anti-oksidanter som allerede antydet, som vil bli diskutert nedenfor. ORAC-analyser bekreftet at furosemid er en effektiv antioksidant, være minst equipotent med vitamin E–relaterte Trolox. Basert på furosemide aktivitet, så vel som positive resultater med flere etablerte antioksidanter og negative resultater med L-644, 711 og ROMPA, Hamelink et al., (2005) foreslo at furosemide beskyttelse kan være mer nøye sammen med sin antioksidant egenskaper enn med ødem reduksjon. Vi vil imidlertid understreke at ingen bekreftende hjerne ødem vurderinger som ble gjort i den nevnte studien. For eksempel, hvis overstadig alkohol–indusert hjerne ødem hadde blitt funnet å være upåvirket in vivo av L-644, 711 eller ROMPA for blod-hjerne-barrieren, metabolske, eller andre grunner, Hamelink et al. (2005) konklusjoner ville, etter vår mening, til å kreve revisjon. Og til det punktet, BOMS ikke klarte å hindre ødem i HEKTIS skiver binge-utsatt for alkohol (Fig. 5C)., I tillegg, hvis en mekanisme for andre enn ødem avskrekking (for eksempel frie radikaler fangst) var den viktigste neuroprotective en ansatt ved furosemide, den vanndrivende ville ha vært forventet å redusere overstadig alkohol–indusert neurodamage i alle berørte områder, men det klarte ikke å gjøre det i olfactory bulb glomeruli (Collins et al., 1998), et område som ikke er undersøkt av Hamelink et al. (2005).,

Tabell 1 oppsummerer også at, til tross for mangler antioksidant kapasitet, ATZ vanndrivende, det primære fokus for disse aktuelle eksperimenter, forhindret overstadig alkohol–indusert vev vann oppsamling og neurodegeneration både i HEKTIS skive kulturer og in vivo. En karboanhydrasehemmer og cerebrovascular dilator stimulus (Settakis et al., 2003), ATZ har blitt rapportert å redusere iskemisk hjerne ødem i rotter (Czernicki et al., 1994), men det er tydeligvis ingen ytterligere informasjon som knytter vanndrivende til mulige neuroprotection., Videre, og spesielt relevant i forhold til våre alkohol eksperimenter, ATZ og flere arylsulfonamide isomerene har vist seg å potently hemme AQP4 vann kanal (Huber et al., 2007), og den mulige betydningen av denne effekten er drøftet nærmere nedenfor.

Torasemide, et sulfonylurea-basert stoff som er ansett som en mer potent sløyfe vanndrivende enn furosemide men, i henhold til ORAC resultater, har ingen antioksidant evner, har hatt en viss suksess som en neuroprotective agent i slag/ødem modeller (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Det er også selektivt hemmer Cl− transport-relaterte glial hevelse, dempe acidose-avhengige, men ikke ekstracellulære glutamat-vakte celle volum øker (Staub et al., 1993). I vår HEKTIS skive kulturer, torasemide i stor grad blokkert LDH utgivelsen fremkalt av overstadig alkohol eksponering/uttak. Selv om torasemide kan beskytte gjennom andre molekylære mekanismer som for eksempel blokkering av angiotensin/angiotensin reseptor trasé (Fortuno et al. I 1999; Muniz et al.,, 2001), resultatet er i overensstemmelse med det syn at hjernevev overhydration og dens nedstrøms effekter er potensielt viktige faktorer i alkohol er neurotoxic mekanisme.

feil av L-644, 711 å beskytte mot overstadig alkohol–indusert neurotoxicity i HEKTIS skive kulturer (Fig. 6) og in vivo (Hamelink et al., 2005) indikerer at forbindelsen, som først og fremst hindrer Cl−/HCO3− exchange, kan ikke effektivt møte binge alkohol–indusert hjernen vann øker., Selv om det mangler tilstrekkelig prøve for in vivo overstadig alkohol/ødem studier, ser vi at i et slag modell i rotter, L-644, 711 var ineffektive i å redusere hjerne ødem (Cole et al., 1991). Med hensyn til BUM, i harmoni med in vivo resultatene av Hamelink et al. (2005), denne vanndrivende ikke beskytte mot overstadig alkohol neurodamage i HEKTIS skive kultur-modellen. Vi viste videre at, i motsetning til ATZ og furosemide, HEKTIS skive ødem indusert av overstadig alkohol ikke ble forhindret av denne vanndrivende, noe som muligens forklarer sin manglende neuroprotection., Noen betraktninger som kan ligge til grunn for dette er at ROMPA er betydelig mindre potent enn furosemide i form av hemming av Cl− -ekstrudere KCC2 transporter, men er en 500-brett sterkere inhibitor av electroneutral Na+-K+-2Cl− (NKCC1) co-transporter (Payne et al., 2003). Denne forskjellen i potenser er tenkt å danne grunnlag for BUM er rapportert fravær av anti-epileptisk virkninger i forhold til furosemide er hemming av K+-indusert epileptiform aktivitet i hippocampal skiver (Margineanu og Klitgaard, 2006)., Det er derfor mulig at denne divergensen mellom ROMPA og furosemide er også viktig i forbindelse med hemming/forebygging av alkohol-indusert hjerne ødem og neurodegeneration.

et gjensyn med spørsmålet om furosemide og dens effektivitet, vanndrivende er neuroprotective effekt mot overstadig alkohol–indusert skade dermed kan oppstå fra en kombinasjon av handlinger som ikke er tilgjengelige for å BOMS eller L-644, 711. Sin forebygging av alkohol-indusert hjerne ødem (Collins et al.,, 1998) kunne i første stammer fra vanndrivende er potent hemming av hjernen-spesifikke KCC2 co-transporter som nevnt, med resulterende restaurering av mobilnettet ioniske styrke og volum. Av interesse er at apoptotic hendelser forårsaket av etoposide i fibroblaster—det translocation av cytosolic BAX protein til mitokondrier og påfølgende utslipp av mitokondrie cytokrom c—var undertrykt av furosemid (Karpinich et al., 2002)., Forklaringen var at BAX translocation er resultatet av en conformational endring i BAX som følge av ioniske-og pH-endringer i cytosolic miljø, endringer som furosemide kan motvirke via hemming av Cl− ekstrudering. Parenthetically, enten klassisk apoptotic hendelser som cytokrom c utslipp i betydelig grad bidrar til alkohol-indusert neurodegeneration er usikkert, som en studie i overstadig alkohol–beruset rotter ved hjelp av en terminal indikator på apoptosis, TUNEL farging, i stor grad var negative (Obernier et al., 2002)., Likevel, BAX translocation og cytokrom c utgivelsen bør undersøkes i binge alkohol modeller, siden disse hendelsene kan oppstå uavhengig av klassisk apoptosis mekanismer.

Vi ikke spørsmålet, men at ekstra modus furosemide tiltak som kan bidra til å neuroprotection (og eventuelt reduksjon av hjerne ødem) kan godt være antioxidative., Oksidativt stress har blitt postulert av oss og flere andre som grunnleggende for alkohol er neurotoxic mekanisme, ja, som vist i Tabell 1, administrasjon av valgte anti-oksidanter (spesielt cannabidiol, vitamin E, og butylhydroksytoluen) gitt en betydelig neuroprotection i overstadig alkohol–beruset rotter (Hamelink et al., 2005; Mannskaper et al., 2006), men kilder av reaktive oksygen arter (ROS) er imprecisely forstått. Andre potensielle handlinger av furosemide synes å være mindre relevant for alkohol-modeller., Den vanndrivende er rapportert å være en GABA-A-reseptoren antagonist ved konsentrasjoner som ligner de som brukes i HEKTIS skive kulturer, men motsetningen er manifestert først og fremst i lillehjernen og ikke i hippocampus og cortex (Korpi og Luddens, 1997).

En nøkkel tilhørende poenget er at våre foreløpige funn av økt AQP4 under overstadig alkohol–indusert ødem og neurodegeneration i HEKTIS skiver kan være av voksende betydning i form av alkohol er ødem-basert mekanisme. Den aquaporin vann kanal familien består av flere genet produkter, med AQP4 den primære form i hjernen (Gunnarson et al.,, 2004). Mens uttrykt først og fremst i astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), og det er også uttrykt av microglia aktivert av inflammatoriske stimuli (Tomas-Camardiel et al., 2004). Økende bevis indikerer at AQP4 aktivitet spiller en oppmuntre del i mobilnettet (cytotoksiske) glial ødem i dyremodeller av traumer, hjerneslag og iskemi (Taniguchi et al. I 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Selv om den eksakte natur (dvs.,, cytotoksiske versus vasogenic) av overstadig alkohol–avhengige ødem er fortsatt usikkert, vi mistenker at glial ødem er en viktig komponent, og AQP4 vil dermed kunne ha en tidlig neuropathological rolle. Men, det er fortsatt mulig at AQP4 høyde er en mobil overlevelse svar til ødem og tilhørende neuroinflammatory svar stedet for (eller i tillegg til) en utløsende trinn. For eksempel, upregulation av en rekke celledød/overlevelse gener, inkludert AQP4, var assosiert med iskemisk neuroprotection på grunn av inflammatoriske (endotoksin) hjernen preconditioning (Mallard og Hagberg, 2007)., Studier med knockdown eller knockout-modeller er nødvendig for å besvare dette spørsmålet.

Vår nåværende oppfatning er at, etter hva molekylær prosess det er igangsatt, hjerne ødem (i del cytotoksisk) og tilhørende celle stress deformasjon på grunn av repeterende høy alkohol eksponering og uttak fremmer pro-inflammatoriske prosesser som omfatter aktivering av PLA2 og overdreven mobilisering av AA, med økt oksidativt stress som en nedstrøms utfallet (Lehtonen og Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Arbeid Mannskaper et al. (2004) antyder at økt pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks.,, TNFa), kan også være involvert. Mens intracellulære ROS forhøyninger på grunn av alkohol/alkoholabstinens stress og mobile ødem kan oppstå fra en rekke ruter i tillegg til PLA2 (f.eks., cytochromes P450, xantin oksidase, ribonucleotide reduktase, NADPH oksidase, og mitokondrie lekkasje), AA er noen ganger viktig bidragsyter i en nevrodegenerativ ROS-prosessen (Bobba et al., 2008). AA kunne produsere oksidativt stress enzymatically og nonenzymatically (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004), samt indirekte via NADPH oksidase induksjon (Dana et al.,, 1998); det kan også forverre ødem (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). I tillegg, ROS kan være positive signaler, videre å aktivere PLA2 isoforms (Martinez og Moreno, 2001). Muligens forskjellig fra ROS generasjon, AA kunne fuel cell death prosesser ved å stimulere mitokondrie permeabilitet overgang (Scorrano et al., 2001). Glutamat, utgitt av astrocytic hevelse, så vel som av AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg og Mongin, 1998), kan forverre oksidativt stress via en ikke-excitotoxic vei involverer hemming av glutation biosyntese (oksidativt glutamat toksisitet (Tan et al., 2001). Av notatet, er vår nåværende inhibitor studier med HEKTIS skive kulturer tyder på at blokaden av PLA2 aktivitet er neuroprotective mot overstadig alkohol behandling (Brown et al., 2008)., Men en ytterligere mekanistiske mulighet er potensielle integrerende rolle i alkohol-avhengige neurodamage for kjernefysisk faktor kappa B (NF-kB), en neuroinflammatory-forbundet transkripsjonsfaktor som er rapportert å være oppregulert av flerumettede fettsyrer som AA (Maziere et al., 1999), så vel som med alkohol i kulturer og overstadig alkohol beruselse in vivo (Zima og Kalousova, 2005; Mannskaper et al., 2006; Zou og Mannskap, 2006).,

I sammendraget, siden to diuretika som mangler antioksidantkraft, ATZ og torasemide, forhindre både hjerne ødem og overstadig alkohol–indusert neurodegeneration, vi argumenterer for at hjerne ødem er sannsynlig å være en kritisk faktor som fører til neurodegeneration, med sin undertrykkelse av disse diuretika, så vel som av furosemid (men ikke av BUM eller muligens L-644, 711) å gi en betydelig neuroprotection. Likevel, ekstra beskyttende mekanismer kan finnes for hver av de effektive agenter., Også, AQP4 vann-tv, tydeligvis økt med overstadig alkohol, kan bli viktige i produksjon eller vedlikehold av den observerte ødem. Videre studier er nødvendig for å forstå de mekanismer som repeterende alkohol rus og uttak fremme hjerne ødem, og hvordan/om AQP4 er sentralt involvert.