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Discussione

Abbiamo proposto che l’alcol-indotta degenerazione di entorinale neuroni corticali piramidali e cellule granulo dentato in ratti adulti che si verifica grazie a ripetuti attacchi di esposizione e ritiro è legata in misura significativa ai nonsynaptic cellulare (soprattutto gliali) gonfiore fenomeni., Questa proposta si basava sulla soppressione sia dell’edema cerebrale che della neurodegenerazione in vivo e in vitro è stata ottenuta con la furosemide diuretica, un potente inibitore del K + − Cl-co-trasporto (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998) ; il presente studio riguarda principalmente ATZ e, in misura minore, torasemide e BUM., Tra i risultati chiave qui sono che i canali dell’acqua AQP4 sembrano essere sovraregolati dall’esposizione all’alcol neurotossico in vitro e che ATZ, un diuretico privo di potenza antiossidante—a differenza della furosemide–e anche un potente inibitore dell’attività AQP4, sopprime l’edema cerebrale dipendente dall’alcol e la neurodegenerazione in vitro e in vivo.,

Per verificare il potenziale antiossidante di furosemide e determinare se ATZ e torasemide possedessero o meno capacità simili, abbiamo utilizzato il test ORAC, uno strumento standard ampiamente accettato per le misurazioni dell’attività antiossidante nelle industrie farmaceutiche e alimentari (Huang et al., 2002). Come tutte le stime antiossidanti, il test ORAC ha i suoi difetti, ma il suo uso di radicali perossilici (o idrossilici) come pro-ossidanti lo rende diverso dai saggi che coinvolgono ossidanti che non sono necessariamente pro-ossidanti (Prior et al., 2005). Tuttavia, come sottolineato altrove (Hamelink et al.,, 2005), per una serie di motivi un singolo parametro in vitro dell’attività antiossidante non prevede necessariamente l’attività biologica in vivo.

Per le valutazioni in vitro della neurotossicità dell’alcol da abbuffata, la coltura organotipica della fetta di HEC tende a replicare il modello regionale di degenerazione cerebrale osservato in vivo, con alcune differenze come il danno CA1 a volte evidente e possibilmente il coinvolgimento di NMDAR. Sospettiamo che queste differenze siano legate all’età adolescenziale delle fette di HEC in cultura (overall 4 settimane di età in generale) rispetto al cervello adulto, ma ciò richiede ulteriori studi., Tuttavia, nel mantenere gran parte delle relazioni neurone-glia e della connettività neuronale del cervello in maturazione intatto, le colture di fette cerebrali hanno distinti vantaggi per gli esperimenti di neurotossicità rispetto alle colture ippocampali o corticali disperse (di solito fetali) (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). La neurodegenerazione indotta dall’alcol nelle colture di fette cerebrali ha generalmente richiesto un’esposizione subcronica a concentrazioni che si avvicinano a mM 100 mM, combinate con prelievi (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Tuttavia, tali concentrazioni non sono rare nel binging alcolisti cronici (Lindblad e Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Determinazione della neurodegenerazione nelle colture slice utilizzate PI, una macchia vitale che etichetta i neuroni morenti (Vornov et al., 1991) e rilascio di LDH, una misura generale della neurotossicità nelle colture di fette cerebrali che si correla bene con l’etichettatura PI (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., Per quanto riguarda le condizioni dei media nei nostri esperimenti di brain slice, riconosciamo che sono suscettibili di essere iperosmolari a vari livelli durante l’esposizione all’alcol (coerente con il plasma degli alcolisti durante l’intossicazione (Snyder et al., 1992; Pursell et al., 2001)), ma iso-osmolare durante i periodi di sospensione.

Passando alla metodologia in vivo in questo rapporto, i nostri precedenti studi di neurodegenerazione cerebrale indotta dall’alcol (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) ha utilizzato l’approccio originale per indurre convulsioni da astinenza da alcol (Majchrowicz, 1975) che è stato notato per la prima volta per promuovere la degenerazione dei neuroni piramidali nelle regioni corticali limbiche (specialmente entorinali) e nelle cellule granulari del giro dentato (Switzer et al., 1982). Ciò ha comportato intubazioni di alcol da tre a quattro volte al giorno (9-12 g/kg/die) per una durata di 4 giorni per generare valori medi di BAC episodicamente elevati (360-450 mg/dl), ma con un tasso di mortalità a volte vicino al 40%. Abbiamo modificato il modello per un trattamento meno grave (Collins et al.,, 1998) di una singola intubazione giornaliera di alcol (∼5 g/kg) per 7-10 giorni, producendo valori medi di BAC 2-h di mg 250 mg/dl—ancora considerati intossicazione clinicamente grave (Lowenstein et al., 1990) – e tassi di mortalità più bassi (2 20%); questa modifica è stata utilizzata qui con ATZ. Il fatto che in questo studio i valori giornalieri e aggregati di 2-h BAC non differissero tra alcol e alcol + ratti trattati con ATZ (Fig. 6A) evita la possibilità che concentrazioni più basse di alcol nel cervello possano spiegare le azioni anti-edemiche e neuroprotettive del diuretico.,

L’abbuffata subcronica giornaliera meno grave genera distribuzioni regionali di neuroni degeneranti (argirofili) che sono indistinguibili da—ma meno intensi di—quelli della procedura originale Majchrowicz (1975). Nessuna neuroprotezione significativa è raggiunta tramite inibizione di NMDAR in entrambi i protocolli di intossicazione. Il grado di edema cerebrale indotto è simile in entrambi i modelli di abbuffata; a questo proposito, l’aumento dell’acqua cerebrale nella Figura 6B, sebbene una percentuale apparentemente bassa (0 0,6%), rappresenta quasi il 2,5% di gonfiore cerebrale (Elliott e Jasper, 1949)., In breve, non vi è alcuna indicazione che la procedura originale di intossicazione di Majchrowicz e la sua modifica una volta al giorno differiscano nei meccanismi cellulari responsabili dell’edema cerebrale indotto dall’alcol e della neurodegenerazione.

In concomitanza con l’inibizione del neurodamage, la furosemide sopprimeva l’edema cerebrale nei ratti adulti a causa di intossicazione / astinenza ripetitiva una volta al giorno-un effetto coerente con il blocco del diuretico di Ca2+—gonfiore astrogliale indipendente nelle fette dell’ippocampo epilettogeno (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), né è stato accompagnato da un aumento del NMDAR cerebrale come accertato con il legame MK-801 (Rudolph et al., 1997), sostengono ulteriormente contro un meccanismo eccitotossico prominente. È ancora possibile, come suggerito da studi sui recettori del glutammato ionotropico negli alcolisti (Preuss et al., 2006) e recensito da altri (Tsai e Coyle, 1998), che un’eccessiva trasmissione glutammatergica potrebbe essere coinvolta nelle crisi di astinenza da alcol e nell’attivazione autonoma disturbata., Tuttavia, nei ratti adulti ubriachi di alcol, la densità della neurodegenerazione raggiunge un massimo considerevolmente prima del momento di maggiore attività convulsiva (Majchrowicz, 1975) e non aumenta durante un periodo di sospensione di 36 ore (Collins et al., 1996) – suggerendo che la propensione alle convulsioni e il neurodamage non sono direttamente correlati.

La tabella 1 riassume gli effetti dei tre diuretici sugli effetti dell’alcol binge in vitro e / o in vivo e contrasta questi risultati con i loro potenziali antiossidanti., Sono inclusi i nostri risultati HEC slice culture e gli studi riportati in vivo con BUM e L-644, 711. Include anche i risultati riportati con diversi antiossidanti già allusi, che saranno discussi di seguito. I test ORAC hanno verificato che la furosemide è un antiossidante efficace, essendo almeno equipotente con il Trolox correlato alla vitamina E. Sulla base dell’attività di furosemide, oltre a risultati positivi con diversi antiossidanti stabiliti e risultati negativi con L-644, 711 e BUM, Hamelink et al., (2005) ha suggerito che la protezione di furosemide potrebbe essere più strettamente associata alle sue proprietà antiossidanti che alla riduzione dell’edema. Tuttavia, sottolineiamo che non sono state effettuate valutazioni di edema cerebrale di conferma nello studio sopra menzionato. Ad esempio, se l’edema cerebrale indotto da alcol binge fosse risultato inalterato in vivo da L–644, 711 o BUM per barriera emato-encefalica, metabolica o altri motivi, Hamelink et al. (2005) le conclusioni richiederebbero, a nostro avviso, una revisione. E a quel punto, BUM non è riuscito a prevenire l’edema in fette HEC binge-esposti all’alcol (Fig. 5 QUATER)., Inoltre, se un meccanismo diverso dalla deterrenza dell’edema (come la cattura dei radicali liberi) fosse il principale neuroprotettivo impiegato dalla furosemide, il diuretico avrebbe dovuto ridurre significativamente il neurodamage indotto dall’alcol in tutte le regioni colpite, ma non è riuscito a farlo nei glomeruli del bulbo olfattivo (Collins et al., 1998), una regione non esaminata da Hamelink et al. (2005).,

La Tabella 1 riassume anche che, nonostante la mancanza di capacità antiossidante, il diuretico ATZ, l’obiettivo principale di questi esperimenti attuali, ha impedito l’accumulo di acqua tissutale indotta dall’alcol e la neurodegenerazione sia nelle colture di slice HEC che in vivo. Un inibitore dell’anidrasi carbonica e stimolo dilatatore cerebrovascolare (Settakis et al., 2003), ATZ è stato segnalato per ridurre l’edema cerebrale ischemico nei ratti (Czernicki et al., 1994), ma apparentemente non ci sono ulteriori informazioni che colleghino il diuretico alla possibile neuroprotezione., Inoltre, e in particolare per i nostri esperimenti sull’alcol, ATZ e diversi isomeri di arilsulfonamide hanno dimostrato di inibire potentemente il canale dell’acqua AQP4 (Huber et al., 2007); la possibile importanza di questo effetto è discussa più avanti.

Torasemide, un composto a base di sulfonilurea che è considerato un diuretico del ciclo più potente della furosemide ma, secondo i risultati di ORAC, non possiede alcuna capacità antiossidante, ha avuto un certo successo come agente neuroprotettivo nei modelli di ictus / edema (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Inoltre inibisce selettivamente il gonfiore gliale correlato al trasporto del Cl, attenuando gli aumenti del volume cellulare dipendenti dall’acidosi ma non extracellulari evocati dal glutammato (Staub et al., 1993). Nelle nostre colture HEC slice, torasemide ha in gran parte bloccato il rilascio di LDH evocato dall’esposizione/astinenza da alcol binge. Sebbene la torasemide possa proteggere attraverso altri meccanismi molecolari come il blocco delle vie recettoriali dell’angiotensina/angiotensina (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001), il risultato è coerente con l’opinione che la sovraidratazione del tessuto cerebrale e i suoi effetti a valle sono fattori potenzialmente importanti nel meccanismo neurotossico dell’alcol.

Il fallimento di L-644, 711 per la protezione contro l’alcol binge indotta neurotossicità nelle colture fetta HEC (Fig. 6) e in vivo (Hamelink et al., 2005) indica che il composto, che inibisce principalmente lo scambio Cl−/HCO3, potrebbe non contrastare efficacemente gli aumenti di acqua cerebrale indotti dall’alcol., Anche se manca un campione sufficiente per studi in vivo di alcol/edema, notiamo che in un modello di ictus nei ratti, L-644, 711 era inefficace nel ridurre l’edema cerebrale (Cole et al., 1991). Per quanto riguarda BUM, in armonia con i risultati in vivo di Hamelink et al. (2005), questo diuretico non ha protetto contro il neurodamage dell’alcool di binge nel modello della coltura della fetta di HEC. Abbiamo inoltre dimostrato che, a differenza di ATZ e furosemide, l’edema della fetta HEC indotto dall’alcol binge non è stato prevenuto da questo diuretico, probabilmente spiegando la sua mancanza di neuroprotezione., Alcune considerazioni che potrebbero essere alla base di questo sono che BUM è notevolmente meno potente di furosemide in termini di inibizione del trasportatore KCC2 Cl− -estrusione, ma è un inibitore 500 volte più forte del co-trasportatore electroneutral Na+-K+-2Cl− (NKCC1) (Payne et al., 2003). Si pensa che questa differenza di potenze sia alla base dell’assenza riportata da BUM di effetti antiepilettici rispetto all’inibizione di furosemide dell’attività epilettiforme indotta da K+nelle fette dell’ippocampo (Margineanu e Klitgaard, 2006)., È quindi possibile che questa divergenza tra BUM e furosemide sia importante anche nel contesto dell’inibizione/prevenzione dell’edema cerebrale indotto dall’alcol e della neurodegenerazione.

Rivisitando il problema della furosemide e la sua efficacia, l’effetto neuroprotettivo del diuretico contro il danno indotto dall’alcol potrebbe quindi derivare da una combinazione di azioni non disponibili per BUM o L–644, 711. La sua prevenzione dell’edema cerebrale indotto dall’alcol (Collins et al.,, 1998) potrebbe prima derivare dalla potente inibizione del diuretico del co-trasportatore KCC2 specifico per il cervello come menzionato, con conseguente ripristino della forza ionica cellulare e del volume. Di interesse è che gli eventi apoptotici indotti dall’etoposide nei fibroblasti – la traslocazione della proteina BAX citosolica ai mitocondri e il conseguente rilascio del citocromo c mitocondriale-sono stati soppressi dalla furosemide (Karpinich et al., 2002)., La spiegazione era che la traslocazione di BAX è il risultato di un’alterazione conformazionale in BAX derivante da cambiamenti ionici e pH nell’ambiente citosolico, cambiamenti che la furosemide potrebbe contrastare attraverso l’inibizione dell’estrusione di Cl. Parenteticamente, se gli eventi apoptotici classici come il rilascio del citocromo c contribuiscano in modo significativo alla neurodegenerazione indotta dall’alcol è incerto, poiché uno studio su ratti intossicati da alcol binge utilizzando un indicatore terminale di apoptosi, la colorazione di TUNEL, era in gran parte negativo (Obernier et al., 2002)., Tuttavia, la traslocazione di BAX e il rilascio del citocromo c dovrebbero essere esaminati nei modelli di binge alcohol, poiché questi eventi possono insorgere indipendentemente dai meccanismi classici di apoptosi.

Non mettiamo in dubbio, tuttavia, che un’ulteriore modalità di azione della furosemide che potrebbe contribuire alla neuroprotezione (e possibilmente alla riduzione dell’edema cerebrale) potrebbe essere antiossidante., Lo stress ossidativo è stato postulato da noi e da molti altri come fondamentale per il meccanismo neurotossico dell’alcol; infatti, come mostrato nella Tabella 1, la somministrazione di antiossidanti selezionati (in particolare cannabidiolo, vitamina E e idrossitoluene butilato) ha fornito una significativa neuroprotezione nei ratti ubriachi di alcol (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), ma le fonti delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono comprese in modo impreciso. Altre potenziali azioni della furosemide sembrano essere meno rilevanti per i modelli alcolici., Il diuretico è segnalato per essere un antagonista del recettore GABA-A a concentrazioni simili a quelle utilizzate nelle colture di fette di HEC, ma l’antagonismo si manifesta principalmente nel cervelletto e non nell’ippocampo e nella corteccia (Korpi e Luddens, 1997).

Un punto chiave associato è che la nostra scoperta preliminare di un aumento di AQP4 durante l’edema indotto dall’alcol e la neurodegenerazione nelle fette di HEC potrebbe essere di importanza emergente in termini di meccanismo basato sull’edema dell’alcol. La famiglia aquaporin water channel è costituita da diversi prodotti genetici, con AQP4 la forma primaria nel cervello (Gunnarson et al.,, 2004). Mentre espresso principalmente in astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), è anche espresso dalla microglia attivata da stimoli infiammatori (Tomas-Camardiel et al., 2004). Prove crescenti indicano che l’attività di AQP4 svolge un ruolo istigante nell’edema gliale cellulare (citotossico) in modelli animali di trauma, ictus e ischemia (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Anche se la natura precisa (cioè,, citotossico contro vasogenico) del binge l’edema alcol-dipendente è ancora incerto, sospettiamo che l’edema gliale sia una componente importante, e AQP4 potrebbe quindi avere un ruolo neuropatologico precoce. Tuttavia, è ancora possibile che l’elevazione di AQP4 sia una risposta di sopravvivenza cellulare all’edema e alle risposte neuroinfiammatorie associate piuttosto che (o in aggiunta a) un passo causale. Ad esempio, la sovraregolazione di un certo numero di geni di morte/sopravvivenza cellulare, incluso AQP4, è stata associata alla neuroprotezione ischemica a causa del precondizionamento cerebrale infiammatorio (endotossina) (Mallard e Hagberg, 2007)., Sono necessari studi con modelli di knockdown o knockout per rispondere a questa domanda.

La nostra visione attuale è che, con qualsiasi processo molecolare sia avviato, l’edema cerebrale (in parte citotossico) e la deformazione dello stress cellulare associata a causa dell’esposizione e del ritiro ripetitivi ad alta alcol promuove processi pro-infiammatori che comprendono l’attivazione di PLA2 e l’eccessiva mobilizzazione di AA, con un aumento dello stress ossidativo come risultato a valle (Lehtonen e Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Il lavoro di Crews et al. (2004) suggerisce che le citochine proinfiammatorie aumentate (per esempio,, TNFa), può anche essere coinvolto. Mentre gli aumenti intracellulari del ROS dovuti allo stress da astinenza da alcol/alcol e all’edema cellulare possono derivare da una serie di vie oltre a PLA2 (ad esempio, citocromi P450, xantina ossidasi, ribonucleotide reduttasi, NADPH ossidasi e perdita mitocondriale), AA è talvolta il principale contributore in un processo ROS neurodegenerativo (Bobba et al., 2008). AA potrebbe produrre lo stress ossidativo enzimaticamente e nonenzimaticamente (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) così come indirettamente tramite induzione di NADPH ossidasi (Dana et al.,, 1998); potrebbe anche aggravare l’edema (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Inoltre, i ROS potrebbero essere segnali di feedback positivi, attivando ulteriormente le isoforme PLA2 (Martinez e Moreno, 2001). Possibilmente distinto dalla generazione di ROS, AA potrebbe processi di morte delle cellule a combustibile stimolando la transizione di permeabilità mitocondriale (Scorrano et al., 2001). Glutammato, rilasciato dal gonfiore astrocitico e da AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg e Mongin, 1998), può esacerbare lo stress ossidativo attraverso una via non eccitotossica che coinvolge l’inibizione della biosintesi del glutatione (tossicità ossidativa del glutammato (Tan et al., 2001). Da notare, i nostri attuali studi sugli inibitori con colture HEC slice indicano che il blocco dell’attività PLA2 è neuroprotettivo contro il trattamento con alcol binge (Brown et al., 2008)., Tuttavia, un’ulteriore possibilità meccanicistica è il potenziale ruolo integrativo nel neurodamage alcol-dipendente per il fattore nucleare kappa B (NF-kB), un fattore di trascrizione neuroinfiammatorio associato che è segnalato per essere sovraregolato da acidi grassi polinsaturi come AA (Maziere et al., 1999) così come dall’alcol nelle culture e dall’intossicazione da alcol in vivo (Zima e Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou e Crews, 2006).,

In sintesi, dal momento che due diuretici che la mancanza di potere antiossidante, ATZ e torasemide, impedire l’edema cerebrale e binge neurodegenerazione indotta da, noi sosteniamo che l’edema cerebrale è probabile che sia un fattore critico che porta alla neurodegenerazione, con la sua soppressione da parte di questi diuretici, così come da furosemide (ma non da BARBONE o, eventualmente, L-644, 711), offrendo importanti neuroprotezione. Tuttavia, potrebbero esistere meccanismi protettivi aggiuntivi per ciascuno degli agenti efficaci., Inoltre, i canali dell’acqua AQP4, evidentemente aumentati dall’alcol binge, potrebbero essere importanti nella generazione o nel mantenimento dell’edema osservato. Sono necessari ulteriori studi per comprendere i meccanismi con cui l’intossicazione da alcol ripetitivo e il ritiro promuovono l’edema cerebrale e come/se AQP4 è coinvolto centralmente.