PMC (Svenska)

Diskussion

Vi har föreslagit att alkohol-inducerad degeneration av entorinal kortikala pyramidal nervceller och dentate granulat celler hos vuxna råttor som uppstår på grund av repetitiva anfall av exponering och uttag är kopplad till en betydande del att nonsynaptic cellular (särskilt gliaceller) svullnad fenomen., Detta förslag baserades på undertryckande av både hjärnödem och neurodegeneration in vivo och in vitro uppnåddes med diuretikum furosemid, en potent k+-CL− Co-transport inhibitor (Collins et al., 1998; Corso m.fl., 1998); den nuvarande studien handlar främst om ATZ och, i mindre utsträckning, torasemid och BUM., Bland de viktigaste resultaten här är att AQP4 vatten-kanaler verkar vara upregulated av neurotoxiska binge alkohol exponering för in vitro, och att ATZ, ett diuretikum saknar antioxiderande effekt—till skillnad från furosemid—och också en potent hämmare av AQP4 aktivitet, dämpar binge alkoholberoende hjärnan ödem och neurodegeneration in vitro och in vivo.,

för att verifiera furosemides antioxidantpotential och för att avgöra om ATZ och torasemid hade liknande möjligheter, utnyttjade vi ORAC-analysen, ett allmänt accepterat standardverktyg för antioxidantaktivitetsmätningar inom läkemedels-och livsmedelsindustrin (Huang et al., 2002). Liksom alla antioxidantbedömningar har ORAC-analysen sina brister, men användningen av peroxyl (eller hydroxyl) radikaler som pro-oxidanter gör det annorlunda än analyser som involverar oxidanter som inte nödvändigtvis är pro-oxidanter (Prior et al., 2005). Icke desto mindre, som betonas på annat håll (Hamelink et al.,, 2005), av olika skäl en enda in vitro parameter av antioxidant aktivitet inte nödvändigtvis förutsäga biologisk aktivitet in vivo.

För in vitro-bedömningar av binge-alkoholneurotoxicitet tenderar den organotypa HEC-skivkulturen att replikera det regionala mönster för degenerering av hjärnan som observerats in vivo, med vissa skillnader, såsom ibland uppenbara CA1-skador och eventuellt NMDAR-inblandning. Vi misstänker att dessa skillnader är relaterade till ungdoms ålder av HEC skivor i kultur (4 veckors ålder totalt) i förhållande till vuxen hjärna, men detta kräver ytterligare studier., Men för att behålla mycket av neuron-glia-relationerna och neuronal anslutning av intakt mognande hjärna, har hjärnskivor kulturer tydliga fördelar för neurotoxicitetsförsök över dispergerade (vanligtvis fetala) hippocampala eller kortikala kulturer (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Alkoholinducerad neurodegeneration i hjärnans skivkulturer har i allmänhet krävt subkronisk exponering för koncentrationer som närmar sig 100 mM, kombinerat med uttag (Collins et al., 1998; Prendergast m.fl., 2004)., Sådana koncentrationer är dock inte ovanliga i binging kronisk alkoholister (Lindblad och Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion m.fl., 1989). Bestämning av neurodegeneration i skivkulturerna använde PI, en vital fläck som märker döende neuroner (Vornov et al., 1991), och LDH release, ett allmänt mått på neurotoxicitet i hjärnskivkulturer som korrelerar bra med Pi-märkning (Bruce et al., 1996; Noraberg m.fl., 1999)., När det gäller medieförhållanden i våra hjärnskivor experiment, erkänner vi att de sannolikt kommer att vara hyperosmolära i varierande grad under alkoholexponeringen (i överensstämmelse med plasma av alkoholister under berusning (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), men iso-osmolar under karenstider.

När det gäller in vivo-metoden i denna rapport, våra tidigare binge alkoholinducerade hjärnneurodegenerationsstudier (Corso et al., 1990; Collins m.fl.,, 1996) utnyttjade det ursprungliga tillvägagångssättet för att inducera alkoholabstinensbeslag (Majchrowicz, 1975) som först noterades för att främja degenerering av pyramidala neuroner i limbiska (särskilt entorhinala) kortikala regioner och granuleceller i dentate gyrus (Switzer et al., 1982). Detta medförde alkohol intubations tre till fyra gånger dagligen (9-12 g/kg/dag) för en 4-dagars löptid för att generera episodiskt hög genomsnittlig BAC värden (360-450 mg/dl), men med en dödlighet ibland närmar sig 40 procent. Vi ändrade modellen till en mindre allvarlig behandling (Collins et al.,, 1998) av en enda daglig alkohol intubation (5 g/kg) för 7-10 dagar, vilket ger genomsnittliga 2-h BAC—värden av 250 mg/dl-fortfarande anses kliniskt allvarlig förgiftning (Lowenstein et al., 1990) – och lägre (20%) dödlighet; denna modifiering användes här med ATZ. Det faktum att de dagliga och aggregerade 2-h BAC-värdena i denna studie inte skilde sig mellan alkohol-och alkohol + ATZ-behandlade råttor (Fig. 6A) undanröjer möjligheten att lägre hjärnalkoholkoncentrationer kan förklara diuretikas Anti-edemiska och neuroprotektiva åtgärder.,

den mindre allvarliga enskilda dagliga subkroniska binge genererar regionala distributioner av degenererade (argyrofila) neuroner som är oskiljbara från—men mindre intensiva än—de i det ursprungliga Majchrowicz (1975) – förfarandet. Ingen signifikant neuroprotektion uppnås genom NMDAR-hämning i något av intoxikationsprotokollet. Graden av inducerad hjärnödem är liknande i båda binge-modellerna; i det avseendet ökar hjärnvattnet i Figur 6B, även om en till synes låg procentandel (0,6%), representerar nästan 2,5% hjärnsvullnad (Elliott och Jasper, 1949)., Kortfattat finns det ingen indikation på att det ursprungliga Majchrowicz-berusningsförfarandet och dess en gång dagligen modifiering skiljer sig åt i de cellulära mekanismerna som är ansvariga för alkoholinducerat hjärnödem och neurodegeneration.

i samband med hämning av neuroskador, furosemid undertryckt hjärnödem hos vuxna råttor på grund av repetitiva en gång dagligen berusning/tillbakadragande-en effekt som överensstämmer med urindrivande blockad av Ca2 + – oberoende astroglial svullnad i epileptogena hippocampal skivor (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), inte heller åtföljdes det av ökad hjärna NMDAR som fastställdes med MK-801 bindning (Rudolph et al., 1997), argumentera vidare mot en framträdande excitotoxisk mekanism. Det är fortfarande möjligt, som föreslagits av studier av jonotropa glutamatreceptorer i alkoholister (Preuss et al., 2006) och granskas av andra (Tsai och Coyle, 1998), att överdriven glutamaterg överföring kan vara involverad i alkoholabstinensbeslag och störd autonom aktivering., Men i binge alkohol–berusade vuxna råttor når densiteten av neurodegeneration maximalt betydligt tidigare än tiden för störst anfallsaktivitet (Majchrowicz, 1975) och ökar inte under en 36-h karenstid (Collins et al., 1996) – vilket tyder på att anfallsbenägenhet och neurodamage inte är direkt relaterade.

tabell 1 sammanfattar effekterna av de tre diuretika på binge alkohol effekter in vitro och / eller in vivo, och kontrasterar dessa fynd med deras antioxidant potentialer., Våra HEC slice-kulturresultat samt de rapporterade in vivo-studierna med BUM och l-644, 711 ingår. Det innehåller också rapporterade resultat med flera antioxidanter som redan nämnts, vilket kommer att diskuteras nedan. ORAC-analyserna verifierade att furosemid är en effektiv antioxidant, som åtminstone är ekvipotent med vitamin E–relaterad Trolox. Baserat på furosemides aktivitet, liksom positiva resultat med flera etablerade antioxidanter och negativa resultat med L-644, 711 och BUM, Hamelink et al., (2005) föreslog att furosemides skydd kunde vara närmare förknippat med dess antioxidantegenskaper än med ödemreduktion. Vi betonar dock att inga bekräftande hjärnödem bedömningar gjordes i ovannämnda studie. Till exempel, om binge alkoholinducerat hjärnödem hade visat sig vara opåverkad in vivo av L–644, 711 eller BUM för blod-hjärnbarriär, metabolisk eller andra skäl, Hamelink et al. (2005) enligt vår mening skulle slutsatserna kräva en översyn. Och till den punkten misslyckades BUM att förhindra ödem i HEC-skivor binge-utsatt för alkohol (Fig. 5C)., Dessutom, om en annan mekanism än ödem avskräckande (såsom fri radikal fångst) var den huvudsakliga neuroprotektiva en anställd av furosemid, skulle diuretikum ha förväntats att avsevärt minska binge alkoholinducerad neuroskada i alla drabbade regioner, men det misslyckades med att göra det i olfaktoriska glödlampa glomeruli (Collins et al., 1998), en region som inte granskats av Hamelink et al. (2005).,

tabell 1 sammanfattar också att, trots att det saknas antioxidantförmåga, förhindrade ATZ-diuretikum, det primära fokuset för dessa nuvarande experiment, binge alkoholinducerad vävnadsvattenackumulering och neurodegeneration både i HEC-skivkulturer och in vivo. En karbanhydrashämmare och cerebrovaskulär dilatorstimulans (Settakis et al., 2003), ATZ har rapporterats minska ischemisk hjärnödem hos råttor (Czernicki et al., 1994), men det finns tydligen ingen ytterligare information som kopplar diuretikumet till eventuell neuroprotektion., Dessutom, och särskilt German till våra alkoholförsök, har ATZ och flera arylsulfonamidisomerer visat sig kraftigt hämma AQP4 vattenkanalen (Huber et al., 2007); den möjliga betydelsen av denna effekt diskuteras nedan.

Torasemide, en sulfonylurea-baserad förening som anses vara en mer potent loop-diuretikum än furosemid, men enligt ORAC resultat, har ingen antioxidant förmåga, har haft viss framgång som en nervskyddande agent i stroke/ödem modeller (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Det hämmar också selektivt CL-transportrelaterad glial svullnad, dämpande acidos-beroende men inte extracellulär glutamat-framkallade cellvolymen ökar (Staub et al., 1993). I våra HEC-skivkulturer blockerade torasemid i stor utsträckning LDH-frisättningen som framkallats av binge alkohol exponering/uttag. Även om torasemid kan skydda genom andra molekylära mekanismer såsom blockering av angiotensin – / angiotensinreceptorvägar (Fortuno et al. 1999; Muniz m.fl.,, 2001), resultatet är förenligt med uppfattningen att övervätskning av hjärnvävnad och dess nedströms effekter är potentiellt viktiga faktorer i alkoholens neurotoxiska mekanism.

misslyckandet av L-644, 711 för att skydda mot binge alkoholinducerad neurotoxicitet i HEC-skivkulturerna (Fig. 6) och in vivo (Hamelink et al., 2005) indikerar att föreningen, som primärt hämmar CL− / HCO3-utbyte, inte effektivt kan motverka binge alkoholinducerad hjärnvatten ökar., Även om det saknas tillräckligt prov för in vivo binge alkohol / ödem studier, noterar vi att i en stroke modell hos råttor, l-644, 711 var ineffektiv för att minska hjärnödem (Cole et al., 1991). När det gäller BUM, i harmoni med in vivo resultaten av Hamelink et al. (2005), detta diuretikum skyddar inte mot binge alkohol neurodamage i HEC skiva kultur-modellen. Vi visade vidare att, till skillnad från ATZ och furosemid, HEC skiva ödem inducerad av binge alkohol inte förhindrades av detta diuretikum, möjligen förklara dess brist på neuroprotektion., Några faktorer som kan ligga bakom detta är att BUM är betydligt mindre potent än furosemid i termer av hämning av Cl – −- strängpressning KCC2 transporter, men är en 500 gånger starkare hämmare av electroneutral Na+-K+-2 cl− (NKCC1) co-transporter (Payne et al., 2003). Denna skillnad i potenser antas ligga till grund för bums rapporterade frånvaro av antiepileptiska effekter jämfört med furosemids hämning av k+-inducerad epileptiform aktivitet i hippocampala skivor (Margineanu och Klitgaard, 2006)., Det är därför möjligt att denna divergens mellan BUM och furosemid också är viktig i samband med hämning/förebyggande av alkoholinducerat hjärnödem och neurodegeneration.

se över frågan om furosemid och dess effektivitet, den diuretiska neuroprotektiva effekten mot binge alkoholinducerad skada kan således uppstå från en kombination av åtgärder som inte är tillgängliga för BUM eller L–644, 711. Dess förebyggande av alkoholinducerat hjärnödem (Collins et al.,, 1998) kan först härröra från diuretikas potenta hämning av den hjärnspecifika kcc2-samtransportören som nämnts, med resulterande återställande av cellulär jonstyrka och volym. Av intresse är att apoptotiska händelser inducerade av etoposid i fibroblaster—translokationen av cytosoliskt BAX-protein till mitokondrier och den därav följande frisättningen av mitokondriell cytokrom C-undertrycks av furosemid (Karpinich et al., 2002)., Förklaringen var att BAX translocation är resultatet av en konformationell förändring i BAX som härrör från Joniska och pH− förändringar i den cytosoliska miljön, förändringar som furosemid kan motverka via hämning av Cl-extrudering. Parentetiskt är huruvida klassiskt apoptotiska händelser som cytokrom C-frisättning bidrar signifikant till alkoholinducerad neurodegeneration osäker, eftersom en studie i binge alkohol-berusade råttor som använder en terminal indikator på apoptos, TUNELFÄRGNING, var till stor del negativ (Obernier et al., 2002)., Icke desto mindre bör BAX translokation och cytokrom C-frisättning undersökas i binge-alkoholmodellerna, eftersom dessa händelser kan uppstå oberoende av klassiska apoptosmekanismer.

vi ifrågasätter emellertid inte att ytterligare furosemid-åtgärder som kan bidra till neuroprotektion (och eventuellt minskning av hjärnödem) kan vara antioxidativa., Oxidativ stress har postulerats av oss och flera andra som grundläggande för alkoholens neurotoxiska mekanism. som framgår av Tabell 1 gav administrering av utvalda antioxidanter (särskilt cannabidiol, vitamin E och butylerad hydroxitoluen) signifikant neuroprotektion hos binge alkohol-berusade råttor (Hamelink et al., 2005; besättningar m.fl., 2006), men källorna till reaktiva syrearter (ROS) är oklart förstådda. Andra potentiella åtgärder av furosemid verkar vara mindre relevanta för alkoholmodellerna., Diuretikumet rapporteras vara en GABA-en receptorantagonist vid koncentrationer som liknar de som används i HEC-skivkulturer, men antagonism manifesteras främst i cerebellum och inte i hippocampus och cortex (Korpi och Luddens, 1997).

en viktig associerad punkt är att vår preliminära upptäckt av ökad AQP4 under binge alkoholinducerat ödem och neurodegeneration i HEC–skivor kan vara av framväxande betydelse när det gäller alkoholens ödembaserade mekanism. Aquaporin water channel familjen består av flera genprodukter, med AQP4 den primära formen i hjärnan (Gunnarson et al.,, 2004). Även uttryckt främst i astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), det uttrycks också av mikroglia aktiverad av inflammatoriska stimuli(Tomas-Camardiel et al., 2004). Ökande bevis tyder på att AQP4-aktivitet spelar en initierande del i cellulärt (cytotoxiskt) glialödem i djurmodeller av trauma, stroke och ischemi (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Även om den exakta karaktären (dvs.,, cytotoxiskt kontra vasogent) av det binge alkoholberoende ödemet är fortfarande osäkert, vi misstänker att glialödem är en viktig komponent, och AQP4 kan således ha en tidig neuropatologisk Roll. Det är dock fortfarande möjligt att AQP4-höjd är ett cellulärt överlevnadsrespons på ödemet och tillhörande neuroinflammatoriska svar snarare än (eller förutom) ett orsakssteg. Till exempel var uppreglering av ett antal celldöd/överlevnadsgener, inklusive AQP4, associerad med ischemisk neuroprotektion på grund av inflammatorisk (endotoxin) hjärnförkonditionering (Mallard och Hagberg, 2007)., Studier med knockdown eller knockout modeller behövs för att svara på denna fråga.

vår nuvarande uppfattning är att oavsett vilken molekylär process den initieras, hjärnödem (delvis cytotoxisk) och associerad cellspänningsdeformation på grund av repetitiv hög alkoholexponering och uttag främjar proinflammatoriska processer som omfattar aktivering av PLA2 och överdriven mobilisering av AA, med ökad oxidativ stress som ett nedströmsresultat (Lehtonen och Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Arbetet med besättningar et al. (2004) tyder på att ökade proinflammatoriska cytokiner (t. ex.,, TNFa), kan också vara inblandade. Medan intracellulära ROS-höjningar på grund av alkohol/alkoholavdragsspänningen och cellulärt ödem kan bero på ett antal vägar utöver PLA2 (t.ex. cytokrom P450, xantinoxidas, ribonukleotidreduktas, NADF-oxidas och mitokondriell läckage), är AA ibland den största bidragsgivaren i en neurodegenerativ ROS-process (Bobba et al., 2008). AA kunde framkalla oxidativ stress enzymatiskt och nonenzymatically (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) samt indirekt via NADPH oxidas induktion (Dana et al.,, 1998); det kan också förvärra ödemet (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Dessutom kan ROS vara positiva återkopplingssignaler, vilket ytterligare aktiverar PLA2 isoforms (Martinez och Moreno, 2001). Möjligen skiljer sig från ROS generation, AA kan bränslecelldödsprocesser genom att stimulera mitokondriell permeabilitet övergång (Scorrano et al., 2001). Glutamat, släppt av astrocytisk svullnad såväl som av AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg och Mongin, 1998), kan förvärra oxidativ stress via en icke-excitotoxisk väg som involverar hämning av glutationbiosyntes (oxidativ glutamattoxicitet (Tan et al., 2001). Av notera visar våra nuvarande inhibitorstudier med HEC-skivkulturer att blockad av PLA2-aktivitet är neuroprotektiv mot binge alkoholbehandling (Brown et al., 2008)., En ytterligare mekanistisk möjlighet är emellertid den potentiella integrativa rollen i alkoholberoende neurodamage för nukleär faktor kappa B( NF-kB), en neuroinflammatorisk associerad transkriptionsfaktor som rapporteras uppregleras av fleromättade fettsyror som AA (Maziere et al., 1999), liksom av alkohol i kulturer och binge alkohol berusning in vivo (Zima och Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou och besättningar, 2006).,

Sammanfattningsvis, eftersom två diuretika som saknar antioxidantstyrka, ATZ och torasemid, förhindrar både hjärnödem och binge alkoholinducerad neurodegeneration, hävdar vi att hjärnödem sannolikt kommer att vara en kritisk faktor som leder till neurodegeneration, med dess undertryckande av dessa diuretika, liksom av furosemid (men inte av BUM eller eventuellt L–644, 711) som ger signifikant neuroprotektion. Det kan dock finnas ytterligare skyddsmekanismer för var och en av de effektiva medlen., AQP4 vattenkanaler, uppenbarligen ökade med binge alkohol, kan också vara viktiga vid generering eller underhåll av det observerade ödemet. Ytterligare studier behövs för att förstå de mekanismer genom vilka repetitiv alkoholförgiftning och uttag främjar hjärnödem och hur / om AQP4 är centralt involverad.