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Diskussion

Wir haben vorgeschlagen, dass die alkohol-induzierte Degeneration von entorhinalen kortikalen pyramidalen Neuronen und dentalen Granulatzellen bei erwachsenen Ratten, die aufgrund sich wiederholender Expositions-und Entzugserscheinungen auftritt, in erheblichem Maße mit nichtsynaptischen zellulären (insbesondere glialen) Schwellungsphänomenen zusammenhängt., Dieser Vorschlag basierte auf der Unterdrückung von Hirnödemen und Neurodegeneration in vivo und in vitro wurde mit dem Diuretikum Furosemid, einem potenten K+-Cl− Co-Transport-Inhibitor, erreicht (Collins et al., 1998; Corso et al., 1998); Die vorliegende Studie befasst sich hauptsächlich mit ATZ und in geringerem Maße mit Torasemid und BUM., Zu den wichtigsten Ergebnissen hierin gehören, dass AQP4-Wasserkanäle durch die neurotoxische Binge-Alkohol-Exposition in vitro hochreguliert zu sein scheinen, und dass ATZ, ein Diuretikum ohne antioxidative Wirksamkeit—im Gegensatz zu Furosemid—und auch ein potenter Inhibitor der AQP4–Aktivität, unterdrückt Binge alkoholabhängiges Hirnödem und Neurodegeneration in vitro und in vivo.,

Um das antioxidative Potenzial von Furosemid zu überprüfen und festzustellen, ob ATZ und Torasemid ähnliche Fähigkeiten besaßen oder nicht, verwendeten wir den ORAC-Assay, ein weithin akzeptiertes Standardwerkzeug für Messungen der antioxidativen Aktivität in der Pharma-und Lebensmittelindustrie (Huang et al., 2002). Wie alle antioxidativen Schätzungen weist der ORAC-Assay seine Mängel auf, aber seine Verwendung von Peroxyl-(oder Hydroxyl -) Radikalen als Prooxidantien unterscheidet ihn von Assays, die Oxidantien enthalten, die nicht unbedingt Prooxidantien sind (Prior et al., 2005). Dennoch, wie an anderer Stelle betont (Hamelink et al.,, 2005), aus einer Vielzahl von Gründen ein einzelner In-vitro-Parameter der antioxidativen Aktivität nicht notwendigerweise die biologische Aktivität in vivo vorhersagt.

Für In-vitro-Bewertungen der Binge-Alkohol-Neurotoxizität neigt die organotypische HEC-Slice-Kultur dazu, das in vivo beobachtete regionale Degenerationsmuster des Gehirns zu replizieren, mit einigen Unterschieden, wie z. B. manchmal offensichtlichen CA1-Schäden und möglicherweise NMDAR-Beteiligung. Wir vermuten, dass diese Unterschiede mit dem jugendlichen Alter der HEC-Scheiben in der Kultur (insgesamt∼4 Wochen) im Vergleich zum erwachsenen Gehirn zusammenhängen, aber dies erfordert weitere Studien., Nichtsdestotrotz haben Gehirnscheibenkulturen bei der Beibehaltung eines großen Teils der Neuron-Glia-Beziehungen und der neuronalen Konnektivität intakten reifenden Gehirns deutliche Vorteile für Neurotoxizitätsexperimente gegenüber dispergierten (normalerweise fetalen) Hippocampus-oder Kortikalkulturen (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Alkoholinduzierte Neurodegeneration in Gehirnscheibenkulturen hat im Allgemeinen eine subchrone Exposition gegenüber Konzentrationen von annähernd ∼100 mM in Kombination mit Entnahmen erforderlich gemacht (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Solche Konzentrationen sind jedoch nicht ungewöhnlich bei binginging chronischen Alkoholikern (Lindblad und Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Diener et al., 1989). Bestimmung der Neurodegeneration in den verwendeten Slice-Kulturen PI, ein lebenswichtiger Fleck, der sterbende Neuronen kennzeichnet (Vornov et al., 1991) und LDH-Freisetzung, ein allgemeines Maß für die Neurotoxizität in Gehirnscheibenkulturen, das gut mit der PI-Kennzeichnung korreliert (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., In Bezug auf die Medienbedingungen in unseren Gehirnscheibenexperimenten erkennen wir an, dass sie während der Alkoholexposition wahrscheinlich in unterschiedlichem Maße hyperosmolar sind (im Einklang mit dem Plasma von Alkoholikern während der Intoxikation (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001)), aber iso-osmolar während der Kündigungsfristen.

In Bezug auf die in-vivo-Methodik in diesem Bericht, unsere früheren Binge Alkohol-induzierte Gehirn Neurodegeneration Studien (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) verwendet den ursprünglichen Ansatz Alkoholentzug Anfälle zu induzieren (Majchrowicz, 1975), die zuerst festgestellt wurde, Degeneration von Pyramidenneuronen in limbischen (insbesondere entorhinalen) kortikalen Regionen und Granulatzellen des Gyrus dentate zu fördern (Switzer et al., 1982). Dies führte zu drei-bis viermal täglichen Alkoholintubationen (9-12 g/kg/Tag) über einen Zeitraum von 4 Tagen, um episodisch hohe durchschnittliche BAC-Werte (360-450 mg/dl) zu erzeugen, wobei sich die Sterblichkeitsrate manchmal 40% näherte. Wir modifizierten das Modell auf eine weniger schwere Behandlung (Collins et al.,, 1998) einer einzigen täglichen Alkoholintubation (∼5 g/kg) über 7-10 Tage, was zu durchschnittlichen 2-h—BAC-Werten von ∼250 mg/dl führte-immer noch als klinisch schwere Intoxikation angesehen (Lowenstein et al., 1990) – und niedrigere (∼20%) Sterblichkeitsraten; Diese Modifikation wurde hier mit ATZ verwendet. Die Tatsache, dass in dieser Studie die täglichen und aggregierten 2-h – BAC-Werte zwischen Alkohol-und Alkohol + ATZ-behandelten Ratten nicht unterschieden (Abb. 6A) vermeidet die Möglichkeit, dass niedrigere Alkoholkonzentrationen im Gehirn die antiödemischen und neuroprotektiven Wirkungen des Diuretikums erklären könnten.,

Der weniger schwere einzelne tägliche subchronische Anfall erzeugt regionale Verteilungen degenerierender (argyrophiler) Neuronen, die nicht von denen des ursprünglichen Majchrowicz (1975)—Verfahrens zu unterscheiden sind, aber weniger intensiv sind. Keine signifikante Neuroprotektion wird durch NMDAR-Hemmung in beiden Intoxikationsprotokollen erreicht. Der Grad des induzierten Hirnödems ist in beiden Binge-Modellen ähnlich; In dieser Hinsicht stellt der Anstieg des Gehirnwassers in Abbildung 6B, obwohl ein scheinbar niedriger Prozentsatz (∼0,6%), fast 2,5% Gehirnschwellung dar (Elliott und Jasper, 1949)., Kurz gesagt, es gibt keinen Hinweis darauf, dass sich das ursprüngliche Majchrowicz-Intoxikationsverfahren und seine einmal tägliche Modifikation in den zellulären Mechanismen unterscheiden, die für alkoholbedingte Hirnödeme und Neurodegenerationen verantwortlich sind.

Gleichzeitig mit der Hemmung der Neuroschädigung unterdrückte Furosemid das Hirnödem bei erwachsenen Ratten aufgrund einer sich wiederholenden einmal täglichen Intoxikation—Entzug-eine Wirkung, die mit der Blockade des Diuretikums übereinstimmt Ca2+ – unabhängige astrogliale Schwellung bei epileptogenen Hippocampus-Scheiben (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), noch wurde es von einer erhöhten Gehirn-NMDAR begleitet, wie sie mit MK-801-Bindung festgestellt wurde (Rudolph et al., 1997), weiter gegen einen prominenten exzitotoxischen Mechanismus argumentieren. Es ist immer noch möglich,wie Studien von ionotropen Glutamatrezeptoren bei Alkoholikern (Preuss et al., 2006) und von anderen überprüft (Tsai und Coyle, 1998), dass eine übermäßige glutamaterge Übertragung an Anfällen von Alkoholentzug und gestörter autonomer Aktivierung beteiligt sein könnte., Bei alkoholvergifteten erwachsenen Ratten erreicht die Dichte der Neurodegeneration jedoch ein Maximum, das wesentlich früher als der Zeitpunkt der größten Anfallsaktivität liegt (Majchrowicz, 1975) und während einer 36-h-Entzugsperiode nicht zunimmt (Collins et al., 1996) – was darauf hindeutet, dass Anfallsneigung und Neuroschädigung nicht direkt zusammenhängen.

Tabelle 1 fasst die Wirkungen der drei Diuretika auf die Wirkung von Alkohol in vitro und/oder in vivo zusammen und kontrastiert diese Ergebnisse mit ihren antioxidativen Potenzialen., Unsere HEC slice Culture Ergebnisse sowie die berichteten in vivo Studien mit BUM und L-644, 711 sind enthalten. Es enthält auch berichtete Ergebnisse mit mehreren bereits angeführten Antioxidantien, auf die im Folgenden eingegangen wird. Die ORAC-Assays bestätigten, dass Furosemid ein wirksames Antioxidans ist, das zumindest äquipotent mit dem Vitamin E-verwandten Trolox ist. Basierend auf der Aktivität von Furosemid sowie positiven Ergebnissen mit mehreren etablierten Antioxidantien und negativen Ergebnissen mit L-644, 711 und BUM, Hamelink et al., (2005) schlug vor, dass der Schutz von Furosemid enger mit seinen antioxidativen Eigenschaften als mit der Ödemreduktion in Verbindung gebracht werden könnte. Wir betonen jedoch, dass in der oben genannten Studie keine bestätigenden Hirnödembewertungen durchgeführt wurden. Zum Beispiel, wenn Binge Alkohol-induziertes Hirnödem in vivo von L-644, 711 oder BUM aus Blut-Hirn-Schranke, metabolischen oder anderen Gründen nicht betroffen war, die Hamelink et al. (2005) Schlussfolgerungen bedürfen unserer Meinung nach einer Überarbeitung. Und bis zu diesem Punkt konnte BUM Ödeme bei HEC-Binge-Exposition gegenüber Alkohol nicht verhindern (Abb. 5C)., Wenn außerdem ein anderer Mechanismus als die Ödemabschreckung (wie das Einfangen freier Radikale) der hauptneuroprotektive Mechanismus von Furosemid war, hätte man erwartet, dass das Diuretikum die durch Alkohol verursachte Binge–Neuroschädigung in allen betroffenen Regionen signifikant reduziert, dies gelang jedoch nicht in den olfaktorischen Bulbenglomeruli (Collins et al., 1998), eine region, die nicht untersucht Hamelink et al. (2005).,

Tabelle 1 fasst auch zusammen, dass ATZ Diuretikum, der Hauptfokus dieser aktuellen Experimente, trotz mangelnder antioxidativer Fähigkeit eine alkoholbedingte Gewebewasseransammlung und Neurodegeneration sowohl in HEC–Slice-Kulturen als auch in vivo verhinderte. Ein Carboanhydrase-Inhibitor und zerebrovaskulärer Dilatator-Stimulus (Settakis et al., 2003) wurde berichtet, dass ATZ ischämische Hirnödeme bei Ratten reduziert (Czernicki et al., 1994), aber es gibt anscheinend keine weiteren Informationen, die das Diuretikum mit einer möglichen Neuroprotektion in Verbindung bringen., Darüber hinaus und insbesondere nach unseren Alkoholexperimenten wurde gezeigt, dass ATZ und mehrere Arylsulfonamidisomere den AQP4-Wasserkanal wirksam hemmen (Huber et al., 2007); die mögliche Bedeutung dieser Effekt wird weiter unten behandelt.

Torasemid, eine Verbindung auf Sulfonylharnstoffbasis, die als potenteres Schleifendiuretikum als Furosemid gilt, aber nach den ORAC-Ergebnissen keine antioxidative Fähigkeit besitzt, hatte einige Erfolge als neuroprotektives Mittel in Schlaganfall – /Ödemmodellen (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Es hemmt auch selektiv die Cl-transportbedingte Glialschwellung, wodurch Azidose-abhängige, aber nicht extrazelluläre Glutamat-evozierte Zellvolumenerhöhungen abgeschwächt werden (Staub et al., 1993). In unseren HEC-Slice-Kulturen blockierte Torasemid weitgehend die LDH-Freisetzung, die durch Alkoholexposition/ – entzug hervorgerufen wurde. Obwohl Torasemid durch andere molekulare Mechanismen wie die Blockierung von Angiotensin/Angiotensin-Rezeptor-Pfaden schützen könnte (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001) steht das Ergebnis im Einklang mit der Ansicht, dass eine Überhydratation des Hirngewebes und seine nachgeschalteten Wirkungen potenziell wichtige Faktoren für den neurotoxischen Mechanismus von Alkohol sind.

Das Versagen von L-644, 711 zum Schutz vor Binge–Alkohol-induzierter Neurotoxizität in den HEC-Slice-Kulturen (Abb. 6) und in vivo (Hamelink et al., 2005) zeigt an, dass die Verbindung, die in erster Linie den Cl−/HCO3− Austausch hemmt, dem durch Alkohol verursachten Gehirnwasseranstieg möglicherweise nicht wirksam entgegenwirkt., Obwohl keine ausreichende Probe für In-vivo-Alkohol – /Ödemstudien vorhanden ist, stellen wir fest, dass L-644, 711 in einem Schlaganfallmodell bei Ratten bei der Verringerung von Hirnödemen unwirksam war (Cole et al., 1991). In Bezug auf BUM, im Einklang mit den in vivo Ergebnissen von Hamelink et al. (2005), dieses Diuretikum schützte im HEC Slice Culture-Modell nicht vor Binge Alcohol-Neuroschäden. Wir haben weiter gezeigt, dass im Gegensatz zu ATZ und Furosemid das durch Alkoholexzesse verursachte HEC-Scheibenödem durch dieses Diuretikum nicht verhindert wurde, was möglicherweise den Mangel an Neuroprotektion erklärt., Einige Überlegungen, die diesem zugrunde liegen könnten, sind, dass BUM in Bezug auf die Hemmung des Cl− -extrudierenden KCC2-Transporters erheblich weniger wirksam ist als Furosemid, aber ein 500-fach stärkerer Inhibitor des elektroneutralen Na+-K+− 2Cl-(NKCC1) – Co-Transporters ist (Payne et al., 2003). Es wird angenommen, dass dieser Unterschied in den Potenzen dem berichteten Fehlen von antiepileptischen Wirkungen von BUM im Vergleich zur Hemmung der K+-induzierten epileptiformen Aktivität von Furosemid in Hippocampusscheiben zugrunde liegt (Margineanu und Klitgaard, 2006)., Es ist daher möglich, dass diese Divergenz zwischen BUM und Furosemid auch im Zusammenhang mit der Hemmung/Prävention von alkoholbedingten Hirnödemen und Neurodegenerationen wichtig ist.

Die neuroprotektive Wirkung des Diuretikums gegen alkoholbedingte Binge–Schäden durch Furosemid und seine Wirksamkeit könnte daher aus einer Kombination von Maßnahmen resultieren, die BUM oder L-644, 711 nicht zur Verfügung stehen. Seine Prävention von Alkohol-induzierten Hirnödemen (Collins et al.,, 1998) könnte zuerst von der potenten Hemmung des hirnspezifischen KCC2-Co-Transporters durch das Diuretikum herrühren, wie erwähnt, mit der daraus resultierenden Wiederherstellung der zellulären Ionenstärke und des Zellvolumens. Von Interesse ist, dass apoptotische Ereignisse, die durch Etoposid in Fibroblasten induziert werden-die Translokation des cytosolischen BAX-Proteins in die Mitochondrien und die daraus resultierende Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom c-durch Furosemid unterdrückt wurden (Karpinich et al., 2002)., Die Erklärung war, dass die BAX-Translokation das Ergebnis einer Konformationsänderung in BAX ist, die sich aus ionischen und pH− Veränderungen im zytosolischen Milieu ergibt, Veränderungen, denen Furosemid durch Hemmung der Cl-Extrusion entgegenwirken könnte. Parenthetisch ist ungewiss, ob klassisch apoptotische Ereignisse wie die Freisetzung von Cytochrom c signifikant zur alkoholinduzierten Neurodegeneration beitragen, da eine Studie an alkoholvergifteten Ratten unter Verwendung eines terminalen Indikators für Apoptose, TUNEL-Färbung, weitgehend negativ war (Obernier et al., 2002)., Dennoch sollten BAX-Translokation und Cytochrom-c-Freisetzung in den Binge-Alcohol-Modellen untersucht werden, da diese Ereignisse unabhängig von klassischen Apoptosemechanismen auftreten können.

Wir stellen jedoch nicht in Frage, dass eine zusätzliche Art der Furosemidwirkung, die zum Neuroprotektion (und möglicherweise zur Verringerung von Hirnödemen) beitragen könnte, antioxidativ sein könnte., Oxidativer Stress wurde von uns und einigen anderen als grundlegend für den neurotoxischen Mechanismus von Alkohol postuliert; Wie in Tabelle 1 gezeigt, sorgte die Verabreichung ausgewählter Antioxidantien (insbesondere Cannabidiol, Vitamin E und butyliertes Hydroxytoluol) für einen signifikanten Neuroprotektion bei alkoholvergifteten Ratten (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), aber die Quellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind ungenau verstanden. Andere potenzielle Wirkungen von Furosemid scheinen für die Alkoholmodelle weniger relevant zu sein., Es wird berichtet, dass das Diuretikum ein GABA-A-Rezeptorantagonist in Konzentrationen ist, die denen in HEC-Slice-Kulturen ähneln, aber der Antagonismus manifestiert sich hauptsächlich im Kleinhirn und nicht im Hippocampus und Kortex (Korpi und Luddens, 1997).

Ein wichtiger assoziierter Punkt ist, dass unser vorläufiger Befund eines erhöhten AQP4 während eines alkoholbedingten Ödems und einer Neurodegeneration in HEC–Scheiben für den ödembasierten Mechanismus des Alkohols von erheblicher Bedeutung sein könnte. Die Aquaporin – Wasserkanalfamilie besteht aus mehreren Genprodukten, wobei AQP4 die primäre Form im Gehirn ist (Gunnarson et al.,, 2004). Während hauptsächlich in Astroglia ausgedrückt (Amiry-Moghaddam et al., 2003) wird es auch durch Mikroglia exprimiert, die durch Entzündungsreize aktiviert wird (Tomas-Camardiel et al., 2004). Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass AQP4-Aktivität eine anstiftende Rolle bei zellulären (zytotoxischen) Gliaödemen in Tiermodellen von Trauma, Schlaganfall und Ischämie spielt (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Obwohl die genaue Natur (d.h.,, zytotoxisch versus vasogen) des binge alkoholabhängigen Ödems noch unsicher ist, vermuten wir, dass Gliaödem ein wichtiger Bestandteil ist und AQP4 somit eine frühe neuropathologische Rolle spielen könnte. Es ist jedoch immer noch möglich, dass die AQP4-Erhöhung eine zelluläre Überlebensreaktion auf das Ödem und die damit verbundenen neuroinflammatorischen Reaktionen ist und nicht (oder zusätzlich) ein ursächlicher Schritt. Zum Beispiel war die Hochregulation einer Reihe von Zelltod – / Überlebensgenen, einschließlich AQP4, mit einer ischämischen Neuroprotektion aufgrund einer entzündlichen (Endotoxin -) Gehirnkonditionierung assoziiert (Mallard und Hagberg, 2007)., Studien mit Knockdown-oder Knockout-Modellen sind erforderlich, um diese Frage zu beantworten.

Unsere derzeitige Ansicht ist, dass Hirnödem (zum Teil zytotoxisch) und die damit verbundene Verformung des Zellstress aufgrund einer sich wiederholenden hohen Alkoholexposition und-entzug durch molekularen Prozess die Aktivierung von PLA2 und die übermäßige Mobilisierung von AA mit erhöhtem oxidativem Stress als einem nachgelagerten Ergebnis fördern (Lehtonen und Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Die Arbeit von Crews et al. (2004) legt nahe, dass erhöhte proinflammatorische Zytokine (z.,, TNFa), kann auch beteiligt sein. Während intrazelluläre ROS-Erhöhungen aufgrund des Alkohol – / Alkoholentzugstresses und des Zellödems zusätzlich zu PLA2 aus einer Reihe von Routen resultieren können (z. B. Cytochrome P450, Xanthinoxidase, Ribonukleotidreduktase, Nadphoxidase und mitochondriale Leckage), AA ist manchmal der Hauptverursacher in einem neurodegenerativen ROS-Prozess (Bobba et al., 2008). AA könnte enzymatisch und nichtenzymatisch oxidativen Stress erzeugen (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) sowie indirekt über NADPH-Oxidase-Induktion (Dana et al.,, 1998); es könnte auch das Ödem verschlimmern (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Darüber hinaus könnte ROS positive Rückkopplungssignale sein, die PLA2-Isoformen weiter aktivieren (Martinez und Moreno, 2001). Möglicherweise unterscheidet sich AA von der ROS-Generation und könnte den Zelltod beschleunigen, indem es den mitochondrialen Permeabilitätsübergang stimuliert (Scorrano et al., 2001). Glutamat, freigesetzt durch astrozytische Schwellung sowie durch AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg und Mongin, 1998), kann oxidativen Stress über einen nicht exzitotoxischen Weg mit Hemmung der Glutathionbiosynthese (oxidative Glutamattoxizität) verschlimmern (Tan et al., 2001). Bemerkenswert ist, dass unsere aktuellen Inhibitorstudien mit HEC-Slice-Kulturen zeigen, dass die Blockade der PLA2-Aktivität neuroprotektiv gegen Binge-Alkohol-Behandlung ist (Brown et al., 2008)., Eine weitere mechanistische Möglichkeit ist jedoch die potenzielle integrative Rolle bei alkoholabhängiger Neuroschädigung für den Kernfaktor Kappa B (NF-kB), einen neuroinflammatorisch assoziierten Transkriptionsfaktor, von dem berichtet wird, dass er durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie AA hochreguliert wird (Maziere et al., 1999) sowie durch Alkohol in Kulturen und Binge Alkoholvergiftung in vivo (Zima und Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou und Crews, 2006).,

Da zwei Diuretika, denen die antioxidative Wirksamkeit fehlt, ATZ und Torasemid, sowohl Hirnödem als auch alkoholbedingte Neurodegeneration verhindern, argumentieren wir, dass Hirnödem wahrscheinlich ein kritischer Faktor ist, der zu Neurodegeneration führt, wobei seine Unterdrückung durch diese Diuretika sowie durch Furosemid (aber nicht durch BUM oder möglicherweise L-644, 711) einen signifikanten Neuroprotektion bietet. Dennoch könnten für jedes der wirksamen Mittel zusätzliche Schutzmechanismen existieren., Auch AQP4-Wasserkanäle, die offensichtlich durch Alkoholexzesse erhöht sind, könnten bei der Erzeugung oder Aufrechterhaltung des beobachteten Ödems wichtig sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die Mechanismen zu verstehen, durch die sich wiederholende Alkoholintoxikation und-entzug Hirnödeme fördern und wie/ob AQP4 zentral beteiligt ist.