PMC (Nederlands)

discussie

we hebben voorgesteld dat alcohol-geïnduceerde degeneratie van entorhinale corticale piramidale neuronen en dentate korrelcellen bij volwassen ratten die optreedt als gevolg van herhaalde periodes van blootstelling en ontwenning in belangrijke mate verbonden is met niet-synaptische cellulaire (vooral gliale) zwellings verschijnselen., Dit voorstel was gebaseerd op de onderdrukking van zowel hersenoedeem als neurodegeneratie in vivo en werd in vitro bereikt met het diureticum furosemide, een krachtige K+-Cl− co-transport remmer (Collins et al., 1998; Corso et al.(1998); de huidige studie heeft voornamelijk betrekking op ATZ en, in mindere mate, torasemide en BUM., Onder de belangrijkste resultaten hierin zijn dat AQP4 waterkanalen lijken te worden upregulated door de neurotoxische binge alcohol blootstelling in vitro, en dat ATZ, een diureticum ontbreekt antioxidant potentie—in tegenstelling tot furosemide—en ook een krachtige remmer van aqp4 activiteit, onderdrukt binge alcohol–afhankelijk hersenoedeem en neurodegeneratie in vitro en in vivo.,om het antioxidantpotentieel van furosemide te verifiëren en om te bepalen of ATZ en torasemide vergelijkbare mogelijkheden hadden, maakten we gebruik van de ORAC-test, een algemeen aanvaard standaardinstrument voor antioxidantactiviteitsmetingen in de farmaceutische en voedingsindustrie (Huang et al., 2002). Zoals alle antioxidant schattingen, de ORAC assay heeft zijn tekortkomingen, maar het gebruik van peroxyl (of hydroxyl) radicalen als pro-oxidanten maakt het anders dan assays die oxidanten die niet noodzakelijk pro-oxidanten (Prior et al., 2005). Niettemin, zoals elders benadrukt (Hamelink et al .,, 2005), om een verscheidenheid van redenen voorspelt één enkele in vitro parameter van antioxidantactiviteit niet noodzakelijk biologische activiteit in vivo.

voor in-vitro-beoordelingen van neurotoxiciteit door binge alcohol heeft de organotypische HEC-slicekultuur de neiging om het regionale hersendegeneratiepatroon dat in vivo werd waargenomen, te repliceren, met enkele verschillen zoals soms evidente CA1-schade en mogelijk betrokkenheid van NMDAR. We vermoeden dat deze verschillen gerelateerd zijn aan de adolescente leeftijd van de HEC-plakjes in de cultuur (∼4 weken in totaal) ten opzichte van volwassen hersenen, maar dit vereist verder onderzoek., Niettemin, in het behouden van veel van de neuron-glia relaties en neuronale connectiviteit van intacte rijpende hersenen, hersenen slice culturen hebben duidelijke voordelen voor neurotoxiciteit experimenten over verspreide (meestal foetale) hippocampale of corticale culturen (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). Alcohol-geïnduceerde neurodegeneratie in hersenen slice culturen heeft over het algemeen vereist subchronische blootstelling aan concentraties bijna ∼100 mM, gecombineerd met onttrekkingen (Collins et al., 1998; Prendergast et al., 2004)., Echter, dergelijke concentraties zijn niet ongewoon in binging chronische alcoholisten (Lindblad en Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et al., 1989). Bepaling van neurodegeneratie in de slice culturen gebruikt PI, een vitale vlek die stervende neuronen labelt (Vornov et al., 1991), en LDH release, een algemene maat voor neurotoxiciteit in breinplakculturen die goed correleert met PI-etikettering (Bruce et al., 1996; Noraberg et al., 1999)., Met betrekking tot de media condities in onze brain slice experimenten, erkennen we dat ze waarschijnlijk hyperosmolair zijn in verschillende mate tijdens de blootstelling aan alcohol (consistent met het plasma van alcoholisten tijdens intoxicatie (Snyder et al., 1992; Purssell et al., 2001), maar iso-osmolair tijdens wachttijden.

wat betreft de in vivo methodologie in dit rapport, onze eerdere binge alcohol-geïnduceerde hersenneurodegeneratie studies (Corso et al., 1990; Collins et al.,, 1996) gebruikte de oorspronkelijke benadering om alcoholontwenningsaanvallen te veroorzaken (Majchrowicz, 1975) die voor het eerst werd opgemerkt om degeneratie van piramidale neuronen in limbische (vooral entorhinale) corticale gebieden en korrelcellen van de dentaat gyrus te bevorderen (Switzer et al., 1982). Dit leidde tot alcoholintubaties drie tot vier keer per dag (9-12 g/kg/dag) gedurende 4 dagen om episodicaal hoge gemiddelde BAC-waarden (360-450 mg/dl) te genereren, maar met een sterftecijfer dat soms de 40% benadert. We hebben het model aangepast aan een minder ernstige behandeling (Collins et al.,, 1998) van een enkele dagelijkse alcoholintubatie (∼5 g/kg) gedurende 7-10 dagen, wat Gemiddelde 2-h BAC waarden oplevert van ∼250 mg / dl-nog steeds beschouwd als klinisch ernstige intoxicatie (Lowenstein et al., 1990) – en lagere (∼20%) sterftecijfers; deze wijziging werd hier gebruikt met ATZ. Het feit dat in deze studie de dagelijkse en geaggregeerde 2-h BAC waarden niet verschilden tussen alcohol-en alcohol + ATZ-behandelde ratten (Fig. 6A) elimineert de mogelijkheid dat lagere hersenenalcoholconcentraties anti-edemische en neuroprotectieve acties van het diureticum kunnen verklaren.,

de minder ernstige enkelvoudige dagelijkse subchronische binge genereert regionale distributies van degenererende (argyrofiele) neuronen die niet te onderscheiden zijn van—maar minder intens dan—die in de oorspronkelijke Majchrowicz (1975) procedure. In geen van beide intoxicatieprotocollen wordt significante neuroprotectie bereikt door NMDAR-remming. De mate van geïnduceerd hersenoedeem is vergelijkbaar in beide binge modellen; in dat opzicht, de toename van het hersenwater in Figuur 6B, hoewel een schijnbaar laag percentage (0.6 0,6%), vertegenwoordigt bijna 2,5% hersenzwelling (Elliott en Jasper, 1949)., Kortom, er zijn geen aanwijzingen dat de oorspronkelijke Majchrowicz-intoxicatieprocedure en de eenmaal daagse wijziging verschillen in de cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor alcohol-geïnduceerd hersenoedeem en neurodegeneratie.gelijktijdig met remmende neurobeschadiging onderdrukte furosemide het hersenoedeem bij volwassen ratten als gevolg van herhaalde eenmaal daagse intoxicatie/ontwenning-een effect dat consistent is met de blokkade door het diureticum van Ca2+—onafhankelijke astrogliale zwelling in epileptogene hippocampusschijfjes (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), noch ging het gepaard met verhoogde hersenen NMDAR zoals vastgesteld met MK-801 binding (Rudolph et al., 1997), verder pleiten tegen een prominent excitotoxisch mechanisme. Het is nog steeds mogelijk, zoals gesuggereerd door studies van ionotrope glutamaatreceptoren bij alcoholisten (Preuss et al., 2006) en herzien door anderen (Tsai en Coyle, 1998), dat overmatige glutamaterge transmissie betrokken zou kunnen zijn bij alcoholontwenningsaanvallen en verstoorde autonome activering., Bij volwassen ratten met alcoholvergiftiging bereikt de dichtheid van de neurodegeneratie echter aanzienlijk eerder dan het tijdstip van de grootste aanvalsactiviteit (Majchrowicz, 1975) een maximum en neemt gedurende een wachttijd van 36 uur niet toe (Collins et al., 1996) – suggereert dat aanval neiging en neuroschade zijn niet direct gerelateerd.

Tabel 1 geeft een samenvatting van de effecten van de drie diuretica op de effecten van binge alcohol in vitro en/of in vivo, en contrasteert deze bevindingen met hun antioxidant potentieel., Onze HEC slice kweek resultaten evenals de gerapporteerde in vivo studies met BUM en L-644, 711 zijn inbegrepen. Het bevat ook gerapporteerde resultaten met een aantal anti-oxidanten al zinspeelde op, die hieronder zal worden besproken. De ORAC-tests bevestigden dat furosemide een effectieve antioxidant is, die minstens equipotent is met de vitamine E–gerelateerde Trolox. Gebaseerd op de activiteit van furosemide, evenals positieve resultaten met verschillende gevestigde antioxidanten en negatieve resultaten met L-644, 711 en BUM, Hamelink et al., (2005) stelde voor dat de bescherming van furosemide nauwer zou kunnen worden geassocieerd met zijn antioxiderende eigenschappen dan met de vermindering van oedeem. We benadrukken echter dat er in de bovengenoemde studie geen bevestigende beoordelingen van hersenoedeem werden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, als binge alcohol–veroorzaakte hersenenoedeem was gevonden om in vivo door L-644, 711 of BUM voor bloed-hersenbarrière, metabolisch, of andere redenen te worden onaangetast, Hamelink et al. (2005) de conclusies zouden naar onze mening moeten worden herzien. En tot dat punt, BUM niet in geslaagd om oedeem te voorkomen in HEC plakjes binge-blootgesteld aan alcohol (Fig. 5C)., Bovendien, als een mechanisme anders dan oedeem afschrikking (zoals vrije radicalen vangen) was de belangrijkste neuroprotectieve die wordt gebruikt door furosemide, het diureticum zou naar verwachting aanzienlijk verminderen binge alcohol–geïnduceerde neuroschade in alle getroffen regio ‘ s, maar het niet doen in de olfactorische bol glomeruli (Collins et al., 1998), een regio niet onderzocht door Hamelink et al. (2005).,

Tabel 1 vat ook samen dat, ondanks het ontbreken van antioxidant vermogen, ATZ diureticum, de primaire focus van deze huidige experimenten, binge alcohol–geïnduceerde Weefsel water accumulatie en neurodegeneratie zowel in HEC slice culturen en in vivo voorkomen. Een koolzuuranhydraseremmer en cerebrovasculaire dilator stimulus (Settakis et al., 2003), is gemeld dat ATZ ischemisch hersenoedeem bij ratten vermindert (Czernicki et al., 1994), maar er is blijkbaar geen verdere informatie die het diureticum linkt aan mogelijke neuroprotectie., Bovendien, en in het bijzonder relevant voor onze alcoholexperimenten, is aangetoond dat ATZ en verschillende arylsulfonamide-isomeren het aqp4-waterkanaal krachtig remmen (Huber et al., 2007); het mogelijke belang van dit effect wordt hieronder verder besproken.

Torasemide, een op sulfonylureum gebaseerde verbinding die wordt beschouwd als een krachtiger lusdiureticum dan furosemide, maar volgens de ORAC-resultaten geen antioxidantvermogen bezit, heeft enig succes gehad als neuroprotectief middel in beroerte/oedeem-modellen (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Het remt ook selectief de CL-transport-gerelateerde gliale zwelling, waardoor het acidose-afhankelijke maar niet extracellulaire glutamaat-opgewekte celvolume toeneemt (Staub et al., 1993). In onze HEC-slicekweken blokkeerde torasemide grotendeels de LDH-afgifte die werd veroorzaakt door binge-alcoholblootstelling/ – ontwenning. Hoewel torasemide bescherming kan bieden via andere moleculaire mechanismen zoals het blokkeren van angiotensine/angiotensine receptor routes (Fortuno et al., 1999; Muniz et al.,, 2001), komt het resultaat overeen met de opvatting dat overhydratie van hersenweefsel en de stroomafwaartse effecten ervan potentieel belangrijke factoren zijn in het neurotoxische mechanisme van alcohol.

het falen van L-644, 711 om te beschermen tegen binge alcohol–geïnduceerde neurotoxiciteit in de HEC-slicekweken (Fig. 6) en in vivo (Hamelink et al., 2005) geeft aan dat de verbinding, die hoofdzakelijk CL−/HCO3− uitwisseling remt, niet effectief de toename van het binge alcohol–geïnduceerde hersenenwater kan tegengaan., Hoewel het ontbreekt aan voldoende monster voor in vivo binge alcohol/oedeem studies, merken we op dat in een beroerte model bij ratten, l-644, 711 was ineffectief in het verminderen van hersenoedeem (Cole et al., 1991). Met betrekking tot BUM, in harmonie met de in vivo resultaten van Hamelink et al. (2005), dit diureticum niet beschermen tegen binge alcohol neuroschade in de HEC slice cultuur model. Wij toonden verder aan dat, in tegenstelling tot ATZ en furosemide, HEC-plakoedeem veroorzaakt door binge alcohol niet door dit diureticum werd verhinderd, misschien het gebrek aan neuroprotectie verklaart., Sommige overwegingen die hieraan ten grondslag zouden kunnen liggen zijn dat BUM aanzienlijk minder machtig is dan furosemide in termen van remming van de CL− extruding kcc2 transporter, maar een 500-voudige sterkere inhibitor van de elektroneutrale Na+-K+-2Cl-(NKCC1) copransporter (Payne et al., 2003). Dit verschil in potenties wordt verondersteld ten grondslag te liggen aan BUM ’s gerapporteerde afwezigheid van anti-epileptische effecten in vergelijking met furosemide’ s remming van K+-geïnduceerde epileptiforme activiteit in hippocampale plakjes (Margineanu en Klitgaard, 2006)., Het is daarom mogelijk dat deze divergentie tussen BUM en furosemide ook belangrijk is in de context van remming/preventie van alcohol-geïnduceerd hersenoedeem en neurodegeneratie.wanneer we de kwestie van furosemide en de werkzaamheid ervan opnieuw bekijken, kan het neuroprotectieve effect van het diureticum tegen door binge alcohol veroorzaakte schade dus ontstaan door een combinatie van acties die BUM of L–644, 711 niet ter beschikking staan. De preventie van alcohol-geïnduceerde hersenoedeem (Collins et al.,, 1998) zou eerst kunnen voortvloeien uit de krachtige remming van het diureticum van de hersenen-specifieke kcc2 copransporter zoals vermeld, met resulterend herstel van cellulaire Ionische sterkte en volume. Van belang is dat apoptotische gebeurtenissen geïnduceerd door etoposide in fibroblasten – de translocatie van cytosolisch Bax-eiwit aan de mitochondriën en de daaruit voortvloeiende afgifte van mitochondriale cytochroom c-werden onderdrukt door furosemide (Karpinich et al., 2002)., De verklaring was dat Bax translocatie het resultaat is van een conformationele verandering in BAX als gevolg van ionische en pH veranderingen in het cytosolische milieu, veranderingen die furosemide zou kunnen tegengaan door remming van CL− extrusie. Parenthetisch is het onzeker of klassiek apoptotische voorvallen zoals de afgifte van cytochroom c significant bijdragen aan door alcohol geïnduceerde neurodegeneratie, aangezien een studie bij ratten met een alcoholinfarct met een terminale indicator van apoptosis, TUNELKLEURING, grotendeels negatief was (Obernier et al., 2002)., Niettemin, BAX translocatie en cytochroom C release moeten worden onderzocht in de binge alcohol modellen, aangezien deze gebeurtenissen onafhankelijk van klassieke apoptose mechanismen kunnen ontstaan.

we twijfelen er echter niet aan dat extra werkingswijze van furosemide die zou kunnen bijdragen aan neuroprotectie (en mogelijk de vermindering van hersenoedeem) wel degelijk antioxidatief zou kunnen zijn., Oxidatieve stress is door ons en verscheidene anderen gepostuleerd als fundamenteel voor het neurotoxische mechanisme van alcohol; inderdaad, zoals getoond in Tabel 1, leverde de toediening van geselecteerde anti-oxidanten (met name cannabidiol, vitamine E en gebutyleerd hydroxytolueen) significante neuroprotectie bij ratten met alcoholvergiftiging (Hamelink et al., 2005; Crews et al., 2006), maar de bronnen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn onnauwkeurig begrepen. Andere mogelijke acties van furosemide lijken minder relevant te zijn voor de alcoholmodellen., Het diureticum wordt gemeld om een GABA-een receptorantagonist bij concentraties gelijkend op die in HEC-schijfculturen worden gebruikt, maar het antagonisme manifesteert zich hoofdzakelijk in het cerebellum en niet in de hippocampus en cortex (Korpi en Luddens, 1997).

een belangrijk geassocieerd punt is dat onze voorlopige bevinding van verhoogde AQP4 tijdens binge alcohol–geïnduceerd oedeem en neurodegeneratie in HEC-plakjes van opkomende betekenis zou kunnen zijn in termen van op alcohol oedeem gebaseerd mechanisme. De aquaporin waterkanaalfamilie bestaat uit verschillende genproducten, met AQP4 de primaire vorm in de hersenen (Gunnarson et al.,, 2004). Hoewel voornamelijk uitgedrukt in astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), wordt het ook uitgedrukt door microglia geactiveerd door inflammatoire stimuli (Tomas-Camardiel et al., 2004). Toenemend bewijs geeft aan dat aqp4-activiteit een aansturende rol speelt bij cellulair (cytotoxisch) gliaaloedeem in diermodellen van trauma, beroerte en ischemie (Taniguchi et al., 2000; Badaut et al., 2007; Neal et al., 2007). Hoewel de precieze aard (d.w.z.,, cytotoxisch versus vasogeen) van de binge alcohol–afhankelijk oedeem is nog onzeker, we vermoeden dat gliale oedeem is een belangrijke component, en AQP4 zou dus een vroege neuropathologische rol kunnen hebben. Het is echter nog steeds mogelijk dat aqp4-verhoging een cellulaire overlevingsreactie is op het oedeem en de bijbehorende neuro-inflammatoire reacties in plaats van (of naast) een causatieve stap. Bijvoorbeeld, upregulatie van een aantal celdood/overleving genen, met inbegrip van AQP4, werd geassocieerd met ischemische neuroprotectie toe te schrijven aan inflammatoire (endotoxine) hersenen preconditionering (Mallard and Hagberg, 2007)., Studies met knock-down of knockout modellen zijn nodig om deze vraag te beantwoorden.

ons huidige standpunt is dat, door welk moleculair proces het ook wordt geïnitieerd, hersenoedeem (gedeeltelijk cytotoxisch) en geassocieerde celstressdeformatie als gevolg van herhaalde hoge blootstelling aan alcohol en ontwenning pro-inflammatoire processen bevorderen, inclusief activering van PLA2 en overmatige mobilisatie van AA, met verhoogde oxidatieve stress als een downstream resultaat (Lehtonen and Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Het werk van Crews et al. (2004) suggereert dat verhoogde pro-inflammatoire cytokines (bijv.,, TNFa), kan ook betrokken zijn. Terwijl intracellulaire Ros verhogingen als gevolg van de alcohol / alcohol ontwenningsstress en cellulair oedeem kunnen voortvloeien uit een aantal routes naast PLA2 (b.v., cytochromen P450, xanthine oxidase, ribonucleotide reductase, NADPH oxidase, en mitochondriale lekkage), is AA soms de belangrijkste bijdrager in een neurodegeneratief Ros-proces (Bobba et al., 2008). AA kan enzymatisch en niet-enzymatisch oxidatieve stress veroorzaken (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) en indirect via NADPH oxidase inductie (Dana et al.,, 1998); het kan ook het oedeem verergeren (Chan et al., 1983; Winkler et al., 2000). Bovendien kunnen ROS positieve feedback-signalen zijn die PLA2-isovormen verder activeren (Martinez en Moreno, 2001). Mogelijk verschillend van Ros generatie, kon AA celdood processen brandstof door het stimuleren van mitochondriale permeabiliteit overgang (Scorrano et al., 2001). Glutamaat, vrijgegeven door astrocytische zwelling evenals door AA (Freeman et al .,, 1990; Kimelberg and Mongin, 1998), kan oxidatieve stress verergeren via een niet-excitotoxische route waarbij de biosynthese van glutathion wordt geremd (oxidatieve glutamaattoxiciteit (Tan et al., 2001). Van nota, onze huidige inhibitor studies met HEC slice culturen geven aan dat blokkade van PLA2 activiteit neuroprotectief is tegen binge alcohol behandeling (Brown et al., 2008)., Echter, een andere mechanistische mogelijkheid is de potentiële integratieve rol in alcohol-afhankelijke neuroschade voor nucleaire factor kappa B (NF-kB), een neuro-inflammatoire-geassocieerde transcriptiefactor die wordt gemeld te worden upregulated door meervoudig onverzadigde vetzuren zoals AA (Maziere et al., 1999) evenals door alcohol in culturen en binge alcoholintoxicatie in vivo (Zima and Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou and Crews, 2006).,aangezien twee diuretica die geen antioxidant potentie hebben, ATZ en torasemide, zowel hersenoedeem als door binge alcohol geïnduceerde neurodegeneratie voorkomen, stellen wij dat hersenoedeem waarschijnlijk een kritische factor is die leidt tot neurodegeneratie, met onderdrukking door deze diuretica en door furosemide (maar niet door BUM of mogelijk L–644, 711) die een significante neuroprotectie biedt. Niettemin kunnen er voor elk van de werkzame stoffen extra beschermende mechanismen bestaan., Ook AQP4 waterkanalen, blijkbaar verhoogd door binge alcohol, kunnen belangrijk zijn bij het genereren of onderhouden van het waargenomen oedeem. Verdere studies zijn nodig om de mechanismen te begrijpen waardoor herhaalde alcoholintoxicatie en terugtrekking hersenoedeem bevorderen, en hoe/of AQP4 centraal betrokken is.