PMC (Italiano)

Per confermare la duplicazione genomica della regione 5q35.3, abbiamo progettato primer per un test PCR quantitativo in tempo reale (qPCR) utilizzando Primer Express v2.,0 software (Biosistemi Applicati). Abbiamo eseguito qPCR come descritto in precedenza.15 Il numero di copia relativa (RCN) delle sequenze target è stato determinato con il metodo comparativo ΔΔCT. Un RCN fold 1,5 volte è stato utilizzato per la duplicazione. Gli esperimenti qPCR sono stati ripetuti tre volte. I primer utilizzati per i test qPCR sono riportati nella Tabella S1. Il nostro test qPCR ha confermato la microduplicazione e ha anche mostrato una completa segregazione della microduplicazione con il fenotipo della malattia nella famiglia (Figura 2B), suggerendo un possibile evento di inserzione intercromosomiale all’interno della regione critica.,

Abbiamo eseguito interfase bicolore e metafase fluorescenza in situ ibridazione (FISH) per confermare l’inserimento nella famiglia cinese. I cloni del cromosoma artificiale batterico (BAC) CTD-2507I18, RP11-55E17 e RP11-671F22 sono stati selezionati per coprire la regione duplicata di COL23A1 (MIM 610043) su 5q35.3, FHL1 (MIM 300163) su Xq26.3 e F8 (MIM 300841) su Xq28, rispettivamente (Figura 4A). I campioni di DNA RP11-55E17 e RP11-671F22 BAC sono stati etichettati individualmente con SpectrumGreen-dUTP (Abbott Molecular) e il DNA CTD-2507I18 è stato etichettato con Cy3-dUTP (GE Healthcare Life Sciences)., I nuclei interfase e i cromosomi metafase sono stati coibridizzati con una coppia di sonde di riferimento marcate SpectrumGreen-dUTP (segnale verde) e Cy3-dUTP (segnale rosso), contrastate con DAPI e visualizzate mediante microscopia a fluorescenza., Due colori del segnale di PESCE pattern osservati su entrambi i nuclei in interfase (Figura 2C) e cromosomi in metafase (Figura 2D e Figura S2) erano coerenti con un interchromosomal inserimento evento, come indicato dalla presenza di segnali rossi per COL23A1 sul cromosoma 5 omologhi e sul cromosoma X, tra il verde segnali corrispondenti a FHL1 su X26.3 e il tasto F8 sulla Xq28 (Figura 2D e Figura S2).,

Inserimenti intercromosomiali mediati dallo stesso palindromo specifico per l’uomo

(A) Diagramma schematico raffigurante le due inserzioni indipendenti trovate nel presente studio. Le barre solide rosse rappresentano i frammenti inseriti e le dimensioni indicate corrispondono alle coppie di basi (bp). Le linee rosse mostrano l’orientamento degli inserimenti. Vengono mostrate le posizioni delle sonde BAC utilizzate nei pesci bicolore e dei geni RefSeq sulle corrispondenti regioni cromosomiche.,

(B) Diagramma schematico del palindromo umano-specifico 180 bp con una sintesi dei punti di interruzione identificati nel presente studio. I triangoli solidi indicano i punti di interruzione dell’inserimento nelle due famiglie di studio (cinese in rosso e messicano in verde). JBPcn, junction breakpoint nella famiglia cinese; JBPmx, junction breakpoint nella famiglia messicana. I triangoli aperti rappresentano i punti di interruzione della cancellazione negli individui normali (cinese in rosso, messicano in verde e Yoruban in nero). Una barra piena nera rappresenta l’elemento LINE-1 che contiene il JBPcn prossimale., Viene indicata la posizione precisa del JBPcn.

(C) Diagramma schematico che mostra il piccolo palindromo umano specifico a Xq27.1 e le sue sequenze di accompagnamento. La sequenza palindromica a 180 bp è inscatolata. Uno scimpanzé ha due metà del palindromo ma in orientamento diretto. Tutti gli altri tre primati non umani hanno solo la metà del palindromo.

Tutte le posizioni genomiche corrispondono alla sequenza di riferimento umana del febbraio 2009 (GRCh37).,

In parallelo con le analisi CNV e FISH sopra descritte, abbiamo condotto catture mirate e MPS nel probando utilizzando le tecnologie di sequenziamento Roche NimbleGen SeqCap e 454. Due array umani Sequence Capture 385K personalizzati sono stati progettati e prodotti per la prima volta a Roche NimbleGen, ciascuno con 385.000 sonde SeqCap uniche, come determinato dall’algoritmo SSAHA, coprendo l ‘ 88,1% della regione critica mirata tra ZLS3 e ZLS10 (chrX: 135.204.482–140.853.096; GRCh37, hg19) (Figura 1E)., Il DNA catturato è stato sequenziato su un sistema FLX Sequencer genoma con lunga lettura GS FLX Titanium series chimica a Roche 454 Life Sciences. Le letture di sequenza risultanti sono state mappate al riferimento umano hg18 con il software GS Reference Mapper e ammontano a 555 Mb di dati di sequenza con circa il 98% mappato alla regione mirata. Ulteriori analisi con il software 454 GS Reference Mapper hanno rivelato le sequenze di giunzione di inserzione distale (Figura S3), individuando il punto di interruzione all’interno del cromosoma X (chrX: 139.502.951) al centro di una breve sequenza palindromica di 180 bp a Xq27.,1, che si trova 82 kb a valle di SOX3 (MIM 313430) (Figura S2, Figure 4A e 4B). Abbiamo usato la PCR a lungo raggio per amplificare le giunzioni di inserimento. I primer sono stati progettati a partire dalle sequenze che fiancheggiano il palindromo a Xq27.1 e dai punti di interruzione sulla base delle coordinate genomiche dell’array SNP 6.0., Analisi di sequenza del risultante amplificati dal sequenziamento di Sanger verificato distale di giunzione trovato nel mirati di sequenziamento genomico (Figura 2F), posto l’altro cromosoma X del punto di interruzione formando prossimale inserimento di giunzione nel mezzo della LINEA 1 elemento al di fuori del piccolo palindromo (Figura 2E e Figura 4B), e ha indicato che il mutante cromosoma X ha avuto un inserimento diretto di un 125,577 bp frammento all’interno di COL23A1 (Figura 2E e 2F, Figura 4A); cioè, der(X)dir ins(X;5)(q27.1;q35.3)., Questo inserimento è stato dimostrato che si verifica in concomitanza con una delezione di 1263 bp tra i due punti di interruzione del cromosoma X a Xq27.1 (Figure 2E e 2F). Coerentemente con il test qPCR, il nostro test PCR di giunzione nella famiglia ha mostrato frammenti specifici delle dimensioni previste in tutti gli individui affetti, ma in nessuno dei membri della famiglia non affetti (Figura 2G).

La scoperta dell’inserimento mediata da una breve sequenza palindromica nella famiglia cinese ci ha spinto ad esaminare la famiglia CGH messicana X-LINKED originariamente riportata (Figura 3A). Uso della matrice SNP 6.,0 per l’esame di quattro membri della famiglia (due interessati e due non interessati) per CNVS ha rivelato una microduplicazione di un frammento >278 kb su 4q31 (SNP_A-2053483 a SNP_A-1883747), che comprende PRMT10 e TMEM184C e che coinvolge parti di ARHGAP10 (MIM 609746) e MIM 131243), nei membri interessati (Figura 3B e Figura 4A). Abbiamo convalidato questa microduplicazione con un test qPCR (Figura 3C) e ottenuto informazioni sul punto di interruzione utilizzando un approccio PCR di giunzione simile (Figure 3D e 3E)., I nostri risultati hanno suggerito che i membri affetti nella famiglia messicana avevano ereditato un cromosoma X mutante con un’inserzione invertita di un frammento di 300.036 bp dalla regione 4q31.22-q31.23 (Figure 3D e 3E, Figura 4A); cioè, der(X)inv ins(X;4)(q27.1;q31.23q31.22). L’esame di tutti i membri della famiglia disponibili per l’inserimento con l’uso di un test PCR di giunzione ha confermato la segregazione dell’evento inserzionale con il fenotipo CGH (Figura 3F)., Molto interessante, entrambi i due punti di interruzione X identificati nella famiglia messicana erano al centro del palindromo (chrX: 139,502,951 e 139,502,958) (Figure 3D e 3E, Figura 4B), rafforzando così il ruolo di questo piccolo palindromo come mediatore nell’avvio delle due inserzioni identificate in questo studio.

Identificazione di un’inserzione intercromosomiale ereditata a Xq27.1 nella famiglia messicana con CGH X-Linked

(A) Pedigree della famiglia messicana di cinque generazioni con CGH X-linked., Gli individui il cui DNA era disponibile sono indicati da”+.”

(B) Stato del numero di copia di una regione genomica di 600 kb sul cromosoma 4q31 che mostra la presenza di una microduplicazione in un individuo affetto. CN, numero di copia.

(C) Convalida della microduplicazione mediante qPCR. RCN, numero di copia relativa. Le barre di errore rappresentano SD.

(D ed E) Analisi di sequenza delle giunzioni di inserzione prossimale (D) e distale (E). Le sequenze di riferimento su Xq27.1 e 4q31 sono indicate rispettivamente in rosso e blu. La giunzione distale contiene una microinserzione di 25 bp.,

(F) PCR amplificazione della giunzione di inserzione prossimale che mostra la segregazione dell’inserzione con il fenotipo.

Tutte le posizioni genomiche corrispondono alla sequenza di riferimento umana del febbraio 2009 (GRCh37).

Abbiamo identificato inserimenti indipendenti mediati dallo stesso piccolo palindromo a Xq27.1 in due diverse famiglie affette da ipertricosi X-linked. Inoltre, la completa segregazione di questi inserimenti con i fenotipi ha fornito ulteriori prove di supporto verso il loro ruolo causale., Per determinare se questi inserimenti fossero unici per queste famiglie e per escludere la possibilità che rappresentino una normale variazione genomica nella popolazione, abbiamo esaminato 740 individui di controllo maschi (215 cinesi, 118 messicani e 407 indiani asiatici) mediante PCR utilizzando primer derivati dalle sequenze che fiancheggiano il palindromo (Tabella S1), e non abbiamo trovato alcun inserimento rilevabile., Inoltre, i CNV che coinvolgono i due segmenti inseriti identificati non sono riportati nel Database pubblico delle Varianti genomiche e non sono presenti in 1274 individui di controllo cinesi (1074 da Shanghai e 200 da Hong Kong). Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che le inserzioni mediate dal palindromo sono la causa sottostante per CGH X-linked isolato e sindromico.

Le sequenze palindromiche non sono stabili e possono indurre riarrangiamenti genomici, incluse delezioni e traslocazioni ricorrenti.16-18 La sequenza palindromica di 180 bp è presente solo negli esseri umani., È affiancato da una ripetizione LINE-1 e una sequenza LTR (Figura 4C). L’esame della regione ortologa nel genoma dello scimpanzé rivela le due metà del palindromo, ma sono in orientamento diretto e sono separate dalla sequenza LTR. Altri primati non umani, tra cui l’orango, il rhesus e l’uistitio, hanno solo la metà del palindromo (Figura 4C). Questi risultati suggeriscono che il palindromo è evolutivamente molto giovane., La suddetta analisi PCR negli individui di controllo ha tuttavia rilevato eliminazioni di dimensioni variabili da 173 bp a 9104 bp in nove individui (due cinesi, due messicani e cinque indiani asiatici) (Tabella S3). Inoltre, una delezione di 209 bp era evidente in un individuo Yoruban sottoposto al sequenziamento dell’intero genoma.19 Notevolmente, tutte queste dieci eliminazioni avevano un punto di interruzione al centro del palindromo (Tabella S3), eliminando così una metà del palindromo. Quindi, sembra che la sequenza palindromica specifica per l’uomo a Xq27.,1 è soggetto a rottura e, quindi, rappresenta un hotspot per i riarrangiamenti genomici, incluso l’inserimento.

Un evento di inserzione intercromosomiale richiede almeno tre eventi di rottura e quindi non è solo più raro ma anche più complesso rispetto ai comuni tipi di riarrangiamenti genomici (microdelezione, microduplicazione e traslocazione terminale). Studi precedenti su inserzioni intercromosomiali microscopicamente visibili stimavano l’incidenza di 1:80.000 nati vivi.,20 Tuttavia, recentemente, l’analisi di ibridazione genomica comparativa (aCGH) basata su array ad alta risoluzione e il PESCE di conferma di 18.000 campioni clinici hanno identificato 40 inserzioni intercromosomiali (1: 500), indicando così che potrebbero non essere così rari come si pensava in precedenza.12 Le inserzioni Interchromosomal possono produrre un fenotipo di malattia alterando l’attività di un gene. Se un gene(i) all’interno dell’inserzione è sensibile al dosaggio, la sua espressione può essere aumentata. L’evento di inserzione può interrompere un gene e causare una perdita o un guadagno di funzione., L’espressione aberrante di un gene può derivare dall’inserimento di una nuova sequenza all’interno o vicino al gene a causa di un effetto di posizione o dell’introduzione di nuove sequenze regolatorie. Nel mutante topo ballerino spontaneo (Dc), un’inserzione intercromosomiale nel primo introne di Tbx10 di un frammento genomico contenente il promotore p23 può causare l’espressione ectopica di Tbx10, producendo così labbro leporino e placca negli omozigoti.,21 Attraverso una combinazione di una scansione CNV basata su microarray ad alta risoluzione e sequenziamento genomico mirato, siamo stati in grado di trovare inserimenti patogeni indipendenti in CGH X-linked. I due eventi di inserzione hanno dimostrato di essere mediati dallo stesso piccolo palindromo che si trova in una regione gene-deserto di 485 kb affiancata telomericamente da SOX3 che codifica il fattore di trascrizione SRY (sex determining region Y)-box 3 (Figura 4A)., SOX3 è il gene candidato più intrigante perché il suo 3′ fine si trova 82 kb telomeric al palindromo e la famiglia SOX di fattori di trascrizione è tra i gruppi più importanti di regolatori dello sviluppo. Postuliamo che le inserzioni mediate dal palindromo identificate nel nostro presente studio potrebbero aver introdotto elementi regolatori specifici del tessuto e quindi indotto l’espressione ectopica di SOX3 nei follicoli piliferi (HFs) o nelle cellule precursori, che potrebbero causare modelli aberranti dei capelli e provocare il fenotipo anormale.,

Mutazioni in SOX3 sono state associate a ritardo mentale legato all’X con deficit isolato dell’ormone della crescita (MIM 300123),22 e anche con ipopituitarismo legato all’X (MIM 312000).23 Microduplicazioni che comprendono SOX3 sono state trovate nell’ipopituitarismo X-linked.23 Nell’ipoparatiroidismo recessivo X-linked (MIM 307700), è stato identificato un inserimento di un frammento intragenico di SNTG2 di circa 340 kb (MIM 608715) su 2p25.3 in un sito Xq27.1 67 kb a valle di SOX3.24 Questo evento di inserimento accompagna una cancellazione di 23-25 kb che include il palindromo specifico per l’uomo., Un effetto di posizione sull’espressione SOX3 è stato suggerito come meccanismo patogeno sottostante.24 Recentemente, Sutton et al. hanno riportato riarrangiamenti genomici, comprese microduplicazioni e una delezione nella regione SOX3, in tre pazienti con XX inversione del sesso maschile (MIM 300833) con punti di interruzione nella regione regolatoria SOX3.25 Sebbene i punti di interruzione precisi di questi riarrangiamenti non siano disponibili dal loro studio, sembra che la regione genomica coinvolta negli eventi di inserimento riportati nel nostro studio sia duplicata in due dei tre pazienti segnalati., I pazienti sopra descritti con ipopituitarismo X-linked, ipoparatiroidismo recessivo X-linked o XX inversione sessuale maschile non hanno il fenotipo ipertricosi.23-25 Inoltre, le femmine con eliminazioni Xq26-q28, che possono causare una perdita di SOX3, sviluppano insufficienza ovarica prematura 1 (MIM 311360) ma non ipertricosi.,26-29 Insieme, questi forniscono supporto alla nostra ipotesi che il CGH X-linked con o senza scoliosi e spina bifida derivi dagli eventi di inserzione che introducono nuovi elementi regolatori del DNA all’interno di ciascuna delle sequenze inserite, piuttosto che dalla creazione di un “effetto di posizione” mediante separazione fisica del gene dai suoi elementi regolatori intrinseci.

SOX3 è strettamente correlato a SOX2 (MIM 184429), il gene che codifica un regolatore chiave per le cellule staminali, ma ad oggi non è noto per essere espresso in HFs., È stato dimostrato che le cellule della papilla dermica che esprimono Sox2 specificano i tipi di HF del topo e inducono la morfogenesi dell’HF.30,31 Con l’uso di RT-PCR (Tabella S1), non è stato possibile rilevare l’espressione di mRNA SOX3 in HFs isolato dal tessuto cutaneo del cuoio capelluto donato da individui sani dopo interventi di chirurgia estetica o da un campione di pelle prelevato dalla parte superiore del braccio del probando della famiglia cinese (Figura S4). Pertanto, sembra ragionevole ipotizzare che le inserzioni mediate dal palindromo potrebbero aver indotto l’espressione ectopica di SOX3 in una fase iniziale dello sviluppo di HF., Il frammento inserito nella famiglia cinese potrebbe contenere ulteriori elementi normativi e, quindi, portare a ulteriori malformazioni, inclusa la scoliosi. Per coincidenza, CNVS su 17q24 vicino a SOX9 (MIM 608160), il gene che codifica un regolatore essenziale delle cellule staminali HF,32,33 causano CGH autosomico-dominante.5 Ulteriori studi sono necessari per determinare se l’espressione aberrante di SOX3 o SOX9 altera il pattern dei capelli come implicato da questi studi.