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Discussion

Nous avons proposé que la dégénérescence induite par l’alcool des neurones pyramidaux corticaux entorhinaux et des cellules granulaires dentées chez les rats adultes, due à des épisodes répétitifs d’exposition et de sevrage, soit liée dans une large mesure aux phénomènes de gonflement cellulaire non synaptique (en particulier glial)., Cette proposition était basée sur la suppression de l’œdème cérébral et de la neurodégénérescence in vivo et in vitro a été réalisée avec le furosémide diurétique, un puissant inhibiteur du transport K+-Cl− co (Collins et al., 1998; Corso et coll., 1998); la présente étude concerne principalement les ZTA et, dans une moindre mesure, le torasémide et le BUM., Parmi les principaux résultats ici sont que les canaux D’eau AQP4 semblent être régulés à la hausse par l’exposition neurotoxique à l’alcoolémie in vitro, et que L’ATZ, un diurétique dépourvu de puissance antioxydante—contrairement au furosémide—et également un puissant inhibiteur de L’activité AQP4, supprime l’œdème cérébral dépendant de l’alcool et la neurodégénérescence in vitro et in vivo.,

pour vérifier le potentiel antioxydant du furosémide et déterminer si L’ATZ et le torasémide possédaient des capacités similaires, nous avons utilisé le test ORAC, un outil standard largement accepté pour les mesures de l’activité antioxydante dans les industries pharmaceutique et alimentaire (Huang et al., 2002). Comme toutes les estimations antioxydantes, le test ORAC a ses lacunes, mais son utilisation de radicaux peroxyle (ou hydroxyle) comme pro-oxydants le rend différent des tests qui impliquent des oxydants qui ne sont pas nécessairement pro-oxydants (Prior et al., 2005). Néanmoins, comme souligné ailleurs (Hamelink et al.,, 2005), pour diverses raisons, un seul paramètre in vitro de l’activité antioxydante ne prédit pas nécessairement l’activité biologique in vivo.

pour les évaluations in vitro de la neurotoxicité de l’alcoolémie, la culture organotypique en tranches HEC tend à reproduire le schéma régional de dégénérescence cérébrale observé in vivo, avec quelques différences telles que des dommages parfois évidents au CA1 et éventuellement une implication du NMDAR. Nous soupçonnons que ces différences sont liées à l’âge adolescent des tranches HEC en culture (∼4 semaines d’âge global) par rapport au cerveau adulte, mais cela nécessite une étude plus approfondie., Néanmoins, en conservant une grande partie des relations neurone-glie et de la connectivité neuronale du cerveau en maturation intact, les cultures de tranches de cerveau présentent des avantages distincts pour les expériences de neurotoxicité par rapport aux cultures hippocampiques ou corticales dispersées (généralement fœtales) (Diekmann et al., 1994; Holopainen, 2005). La neurodégénérescence induite par l’alcool dans les cultures de tranches de cerveau a généralement nécessité une exposition subchronique à des concentrations approchant ∼100 mM, combinée à des retraits (Collins et al., 1998; Prendergast et coll., 2004)., Cependant, de telles concentrations ne sont pas rares chez les alcooliques chroniques (Lindblad et Olsson, 1976; Urso et al., 1981; Minion et coll., 1989). Détermination de la neurodégénérescence dans les cultures de tranches utilisées PI, une tache vitale qui marque les neurones mourants (Vornov et al., 1991), et la libération de LDH, une mesure générale de la neurotoxicité dans les cultures de tranches de cerveau qui est bien corrélée avec le marquage PI (Bruce et al., 1996; Noraberg et coll., 1999)., En ce qui concerne les conditions des milieux dans nos expériences de tranche de cerveau, nous reconnaissons qu’ils sont susceptibles d’être hyperosmolaires à des degrés divers pendant l’exposition à l’alcool (compatible avec le plasma des alcooliques pendant l’intoxication (Snyder et al., 1992; Purssell et coll., 2001)), mais iso-osmolaire pendant les périodes de retrait.

en ce qui concerne la méthodologie in vivo dans ce rapport, nos études antérieures sur la neurodégénérescence cérébrale induite par l’alcoolémie (Corso et al., 1990; Collins et coll.,, 1996) ont utilisé l’approche originale pour induire des crises de sevrage alcoolique (Majchrowicz, 1975) qui a d’abord été noté pour favoriser la dégénérescence des neurones pyramidaux dans les régions corticales limbiques (en particulier entorhinal) et les cellules granulaires du gyrus denté (Switzer et al., 1982). Cela a entraîné des intubations d’alcool trois à quatre fois par jour (9-12 g/kg/jour) pendant une durée de 4 jours pour générer des valeurs moyennes épisodiquement élevées D’alcoolémie (360-450 mg/dl), mais avec un taux de mortalité approchant parfois 40%. Nous avons modifié le modèle pour un traitement moins sévère (Collins et al.,, 1998) d’une seule intubation quotidienne d’alcool (∼5 g/kg) pendant 7 à 10 jours, donnant des valeurs moyennes D’alcoolémie 2-h de mg 250 mg/dl—toujours considérée comme une intoxication cliniquement grave (Lowenstein et al., 1990) – et des taux de mortalité Inférieurs (∼20%); cette modification a été utilisée ici avec ATZ. Le fait que dans cette étude, les valeurs quotidiennes et agrégées de BAC 2-h ne différaient pas entre les rats traités avec alcool et Alcool + ATZ (Fig. 6A) évite la possibilité que des concentrations d’alcool plus faibles dans le cerveau puissent expliquer les actions anti-édémiques et neuroprotectrices du diurétique.,

la frénésie subchronique quotidienne unique moins sévère génère des distributions régionales de neurones dégénératifs (argyrophiles) qui ne se distinguent pas de ceux—mais moins intenses—de la procédure originale de Majchrowicz (1975). Aucune neuroprotection significative n’est obtenue par inhibition du NMDAR dans l’un ou l’autre des protocoles d’intoxication. Le degré d’œdème cérébral induit est similaire dans les deux modèles de frénésie; à cet égard, l’augmentation de l’eau dans le cerveau de la Figure 6B, bien qu’un pourcentage apparemment faible (0,6%∼), représente un gonflement du cerveau de près de 2,5% (Elliott et Jasper, 1949)., En bref, rien n’indique que la procédure originale D’intoxication de Majchrowicz et sa modification une fois par jour diffèrent dans les mécanismes cellulaires responsables de l’œdème cérébral induit par l’alcool et de la neurodégénérescence.

Concomitant à l’inhibition du neurodamage, le furosémide a supprimé l’œdème cérébral chez les rats adultes en raison d’une intoxication/d’un sevrage répétitif une fois par jour – un effet compatible avec le blocage par le diurétique du gonflement astroglial indépendant du Ca2 + dans les tranches de l’hippocampe épileptogène (Hochman et al., 1995)., Lack of neuroprotection in the binge intoxication models by MK-801, 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (non-NMDAR glutamate receptor antagonist), nimodipine, or nitric oxide synthase inhibitors provides no support for a central role for glutamate receptor-dependent excitotoxicity, extracellular Ca2+ uptake, or nitric oxide generation (Zou et al., 1996; Collins et al., 1998; Corso et al., 1998). Also, the facts that binge alcohol–induced neurodegeneration in rats was not reduced by the noncompetitive NMDAR antagonist, memantine (Hamelink et al.,, 2005), il n’était pas non plus accompagné d’une augmentation du NMDAR cérébral tel qu’établi avec la liaison MK-801 (Rudolph et al., 1997), soutiennent en outre un mécanisme excitotoxique important. C’est encore possible, comme le suggèrent les études sur les récepteurs ionotropes du glutamate chez les alcooliques (Preuss et al., 2006) et examiné par D’autres (Tsai et Coyle, 1998), que la transmission glutamatergique excessive pourrait être impliquée dans les crises de sevrage alcoolique et l’activation autonome perturbée., Cependant, chez les rats adultes intoxiqués par l’alcool, la densité de neurodégénérescence atteint un maximum considérablement plus tôt que le moment de la plus grande activité épileptique (Majchrowicz, 1975) et n’augmente pas tout au long d’une période de sevrage de 36 heures (Collins et al., 1996)—suggérant que la propension à la crise et le neurodamage ne sont pas directement liés.

le tableau 1 résume les effets des trois diurétiques sur les effets de l’alcoolémie in vitro et / ou in vivo, et Contraste ces résultats avec leurs potentiels antioxydants., Nos résultats de culture de tranches HEC ainsi que les études in vivo rapportées avec BUM et L-644, 711 sont inclus. Il comprend également des résultats rapportés avec plusieurs antioxydants déjà mentionnés, qui seront discutés ci-dessous. Les analyses ORAC ont vérifié que le furosémide est un antioxydant efficace, étant au moins équipotent avec le trolox lié à la vitamine E. Sur la base de l’activité du furosémide, ainsi que des résultats positifs avec plusieurs antioxydants établis et des résultats négatifs avec L-644, 711 et BUM, Hamelink et al., (2005) ont suggéré que la protection du furosémide pourrait être plus étroitement associée à ses propriétés antioxydantes qu’à la réduction de l’œdème. Cependant, nous soulignons qu’aucune évaluation confirmatoire de l’œdème cérébral n’a été effectuée dans l’étude susmentionnée. Par exemple, si l’œdème cérébral induit par l’alcoolémie n’avait pas été affecté in vivo par L–644, 711 ou BUM pour une barrière hémato-encéphalique, métabolique ou d’autres raisons, Hamelink et al. (2005) les conclusions nécessiteraient, à notre avis, Une révision. Et à ce point, BUM n’a pas réussi à prévenir l’œdème dans les tranches HEC binge-exposé à l’alcool (Fig. 5C)., En outre, si un mécanisme autre que la dissuasion de l’œdème (comme le piégeage des radicaux libres) était le principal neuroprotecteur employé par le furosémide, on aurait pu s’attendre à ce que le diurétique réduise de manière significative le neurodamage induit par l’alcoolémie dans toutes les régions touchées, mais il n’a pas réussi à le faire dans les glomérules du bulbe olfactif (Collins et al., 1998), une région non examinée par Hamelink et al. (2005).,

le tableau 1 résume également que, malgré le manque de capacité antioxydante, le diurétique ATZ, le principal objectif de ces expériences actuelles, a empêché l’accumulation d’eau tissulaire induite par l’alcool et la neurodégénérescence dans les cultures de tranches HEC et in vivo. Un inhibiteur de l’anhydrase carbonique et un stimulus dilatateur cérébrovasculaire (Settakis et al., 2003), ATZ a été rapporté pour réduire l’œdème cérébral ischémique chez le rat (Czernicki et al., 1994), mais il n’y a apparemment pas d’autres informations reliant le diurétique à une possible neuroprotection., De plus, et particulièrement en rapport avec nos expériences sur l’alcool, il a été démontré que L’ATZ et plusieurs isomères d’arylsulfonamide inhibent puissamment le canal D’eau AQP4 (Huber et al., 2007); l’importance possible de cet effet est discutée plus loin.

Le torasémide, un composé à base de sulfonylurée qui est considéré comme un diurétique de l’Anse plus puissant que le furosémide mais, selon les résultats de L’ORAC, ne possède aucune capacité antioxydante, a eu un certain succès en tant qu’agent neuroprotecteur dans les modèles d’AVC/œdème (Plangger, 1992; Staub et al., 1994)., Il inhibe également sélectivement le gonflement glial lié au transport du CL, atténuant les augmentations de volume cellulaire dépendantes de l’acidose mais non extracellulaires évoquées par le glutamate (Staub et al., 1993). Dans nos cultures HEC slice, le torasémide a largement Bloqué la libération de LDH évoquée par l’exposition à l’alcoolémie/le sevrage. Bien que le torasémide puisse protéger par d’autres mécanismes moléculaires tels que le blocage des voies des récepteurs de l’angiotensine/angiotensine (Fortuno et al., 1999; Muniz et coll.,, 2001), le résultat est cohérent avec l’idée que la surhydratation des tissus cérébraux et ses effets en aval sont des facteurs potentiellement importants dans le mécanisme neurotoxique de l’alcool.

l’incapacité de L-644, 711 à protéger contre la neurotoxicité induite par l’alcoolémie dans les cultures de tranches HEC (fig. 6) et in vivo (Hamelink et coll., 2005) indique que le composé, qui inhibe principalement l’échange Cl – / HCO3 -, peut ne pas contrer efficacement l’augmentation de l’eau cérébrale induite par l’alcool., Bien qu’il manque un échantillon suffisant pour les études in vivo sur l’alcoolémie et l’œdème, nous notons que dans un modèle d’AVC chez le rat, L-644, 711 était inefficace pour réduire l’œdème cérébral (Cole et al., 1991). En ce qui concerne BUM, en harmonie avec les résultats in vivo de Hamelink et al. (2005), ce diurétique n’a pas protégé contre le neurodamage de l’alcoolémie dans le modèle de culture en tranches HEC. Nous avons en outre montré que, contrairement à L’ATZ et au furosémide, l’œdème de tranche HEC induit par l’alcoolémie n’était pas empêché par ce diurétique, expliquant peut-être son manque de neuroprotection., Certaines considérations qui pourraient sous-tendre ceci sont que BUM est considérablement moins puissant que le furosémide en termes d’inhibition du transporteur kcc2 de cl – – extrusion, mais est un inhibiteur 500 fois plus fort du co-transporteur électroneutral Na+-K+− 2cl-(NKCC1) (Payne et al., 2003). On pense que cette différence de puissance sous-tend L’absence rapportée D’effets antiépileptiques de BUM par rapport à l’inhibition par le furosémide de L’activité épileptiforme induite par K+dans les tranches de l’hippocampe (Margineanu et Klitgaard, 2006)., Il est donc possible que cette divergence entre BUM et furosémide soit également importante dans le contexte de l’inhibition/prévention de l’œdème cérébral induit par l’alcool et de la neurodégénérescence.

en revisitant la question du furosémide et de son efficacité, l’effet neuroprotecteur du diurétique contre les dommages induits par l’alcoolémie pourrait donc provenir d’une combinaison d’actions non disponibles pour BUM ou L–644, 711. Sa prévention de l’œdème cérébral induit par l’alcool (Collins et al.,, 1998) pourrait d’abord dériver de l’inhibition puissante du diurétique du co-transporteur de kcc2 spécifique au cerveau comme mentionné, avec la restauration résultante de la force et du volume ioniques cellulaires. Il est intéressant de noter que les événements apoptotiques induits par l’étoposide dans les fibroblastes—la translocation de la protéine Bax cytosolique vers les mitochondries et la libération conséquente du cytochrome c mitochondrial—ont été supprimés par le furosémide (Karpinich et al., 2002)., L’explication était que la translocation de BAX est le résultat d’une altération conformationnelle de BAX résultant de changements ioniques et de pH dans le milieu cytosolique, changements que le furosémide pourrait contrer par l’inhibition de L’extrusion de Cl. Entre parenthèses, on ne sait pas si les événements apoptotiques classiques tels que la libération de cytochrome c contribuent de manière significative à la neurodégénérescence induite par l’alcool, car une étude chez des rats intoxiqués par l’alcool en utilisant un indicateur terminal d’apoptose, la coloration de TUNEL, était largement négative (Obernier et al., 2002)., Néanmoins, la translocation du BAX et la libération du cytochrome c doivent être examinées dans les modèles d’alcoolémie, car ces événements peuvent survenir indépendamment des mécanismes d’apoptose classiques.

nous ne remettons pas en question, cependant, que le mode d’action supplémentaire du furosémide qui pourrait contribuer à la neuroprotection (et éventuellement à la réduction de l’œdème cérébral) pourrait bien être antioxydant., Le stress oxydatif a été postulé par nous et plusieurs autres comme fondamental pour le mécanisme neurotoxique de l’alcool; en effet, comme le montre le tableau 1, l’administration d’antioxydants sélectionnés (notamment le cannabidiol, la vitamine E et l’hydroxytoluène butylé) a fourni une neuroprotection significative chez les rats intoxiqués par l’alcool (Hamelink et al. De 2005; les Équipages et coll., 2006), mais les sources des espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont mal comprises. D’autres actions potentielles du furosémide semblent moins pertinentes pour les modèles d’alcool., Le diurétique serait un antagoniste du récepteur GABA-A à des concentrations similaires à celles utilisées dans les cultures de tranches HEC, mais l’antagonisme se manifeste principalement dans le cervelet et non dans l’hippocampe et le cortex (Korpi et Luddens, 1997).

un point clé associé est que notre découverte préliminaire d’une augmentation de L’AQP4 pendant l’œdème induit par l’alcool et la neurodégénérescence dans les tranches de HEC pourrait être d’une importance émergente en termes de mécanisme basé sur l’œdème de l’alcool. La famille des canaux aquaporines se compose de plusieurs produits génétiques, AQP4 étant la forme principale dans le cerveau (Gunnarson et al.,, 2004). Bien qu’exprimé principalement en astroglia (Amiry-Moghaddam et al., 2003), il est également exprimé par la microglie activée par des stimuli inflammatoires (Tomas-Camardiel et coll., 2004). De plus en plus de preuves indiquent que L’activité AQP4 joue un rôle instigateur dans l’œdème glial cellulaire (cytotoxique) dans les modèles animaux de traumatismes, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie (Taniguchi et al., 2000; Badaut et coll., 2007; Neal et coll., 2007). Bien que la nature précise (c’est à dire,, cytotoxique versus vasogénique) de l’hyperphagie l’œdème alcoolo–dépendant est encore incertain, nous soupçonnons que l’œdème glial est un composant important, et AQP4 pourrait donc avoir un rôle neuropathologique précoce. Cependant, il est toujours possible que L’élévation AQP4 soit une réponse de survie cellulaire à l’œdème et aux réponses neuroinflammatoires associées plutôt qu’une étape causale (ou en plus). Par exemple, la régulation à la hausse d’un certain nombre de gènes de mort/survie cellulaire, y compris AQP4, a été associée à une neuroprotection ischémique due à un préconditionnement cérébral inflammatoire (endotoxine) (Mallard et Hagberg, 2007)., Des études avec des modèles knockdown ou knockdown sont nécessaires pour répondre à cette question.

notre point de vue actuel est que, quel que soit le processus moléculaire initié, l’œdème cérébral (en partie cytotoxique) et la déformation liée au stress cellulaire due à une exposition répétitive élevée à l’alcool et au sevrage favorisent les processus pro-inflammatoires englobant l’activation de la PLA2 et la mobilisation excessive de L’AA, avec un stress oxydatif accru comme résultat en aval (Lehtonen et Kinnunen, 1995; Basavappa et al., 1998). Le travail de Crews et al. (2004) suggèrent que l’augmentation des cytokines pro-inflammatoires (p. ex.,, TNFa), peuvent également être impliqués. Alors que les élévations intracellulaires de ROS dues au stress lié à l’alcool/au sevrage alcoolique et à l’œdème cellulaire peuvent résulter d’un certain nombre de voies en plus du PLA2 (par exemple, les cytochromes P450, la xanthine oxydase, la ribonucléotide réductase, la NADPH oxydase et la fuite mitochondriale), AA est parfois le principal contributeur d’un processus neurodégénératif de ROS (Bobba et al., 2008). AA pourrait produire un stress oxydatif enzymatiquement et non enzymatiquement (Chan, 2001; Farooqui et al., 2004) ainsi qu’indirectement par induction de la NADPH oxydase (Dana et al.,, 1998); il pourrait également aggraver l’œdème (Chan et al., 1983; Winkler et coll., 2000). En outre, les ROS pourraient être des signaux de rétroaction positifs, activant davantage les isoformes PLA2 (Martinez et Moreno, 2001). Peut-être distinct de la génération de ROS, AA pourrait processus de mort des piles à combustible en stimulant la transition de perméabilité mitochondriale (Scorrano et al., 2001). Glutamate, libéré par gonflement astrocytaire ainsi que par AA (Freeman et al.,, 1990; Kimelberg et Mongin, 1998), peuvent exacerber le stress oxydatif par une voie non excitotoxique impliquant l’inhibition de la biosynthèse du glutathion (toxicité oxydative du glutamate (Tan et al., 2001). À noter, nos études actuelles sur les inhibiteurs avec des cultures de tranches HEC indiquent que le blocage de L’activité PLA2 est neuroprotecteur contre le traitement par l’alcoolémie (Brown et al., 2008)., Cependant, une autre possibilité mécaniste est le rôle intégrateur potentiel dans le neurodamage dépendant de l’alcool pour le facteur nucléaire kappa B (NF-kB), un facteur de transcription associé à la neuroinflammation qui serait régulé à la hausse par les acides gras polyinsaturés comme AA (Maziere et al., 1999) ainsi que par l’alcool dans les cultures et l’intoxication alcoolique excessive in vivo (Zima et Kalousova, 2005; Crews et al., 2006; Zou et des Équipages, 2006).,

En résumé, étant donné que deux diurétiques qui manquent de pouvoir antioxydant, ATZ et torasémide, préviennent à la fois l’œdème cérébral et la neurodégénérescence induite par l’alcool, nous soutenons que l’œdème cérébral est susceptible d’être un facteur critique menant à la neurodégénérescence, avec sa suppression par ces diurétiques, ainsi que par le furosémide (mais pas par BUM ou Néanmoins, des mécanismes de protection supplémentaires pourraient exister pour chacun des agents efficaces., En outre, les canaux D’eau AQP4, manifestement augmentés par l’alcoolémie, pourraient être importants dans la génération ou le maintien de l’œdème observé. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes par lesquels l’intoxication alcoolique répétitive et le sevrage favorisent l’œdème cérébral, et comment/si AQP4 est impliqué au centre.